[摘要]
目的
探討CCL5/CCR5生物軸在涎腺腺樣囊性癌（SACC）細胞嗜神經侵襲中的作用。方法 應用細胞免疫熒光技術和流式細胞術檢測SACC-LM細胞中趨化因子受體CCR5的表達；應用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測周圍神經細胞培養上清液中趨化因子CCL5的表達。應用流式細胞術檢測CCL5對SACC-LM細胞內F肌動蛋白的作用，并通過劃痕和侵襲實驗觀察趨化因子CCL5和其受體CCR5對SACC-LM細胞運動能力和侵襲能力的作用。結果 SACC-LM細胞高表達趨化因子受體CCR5；周圍神經原代培養上清液中趨化因子CCL5質量濃度為（359.2±15.8）、（696.4±22.6） pg·mL-1；趨化因子CCL5和其受體CCR5結合后對SACC-LM細胞的運動能力和侵襲能力可以產生促進作用。結論 CCL5/CCR5生物軸可能在SACC細胞嗜神經侵襲中起著重要的作用。
[關鍵詞]
唾液腺； 涎腺腺樣囊性癌； CCL5； CCR5； 嗜神經侵襲
涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是一種較少見的惡性腫瘤，對周圍神經侵襲的傾向性被視為SACC的特征性生物學行為之一[1]。在臨床上，周圍神經侵襲（peripheral nerve invasion，PNI）與SACC的擴散、復發和預后密切相關[2-3]。在對SACC周圍神經侵襲性的研究中，國內外學者已經發現了許多相關蛋白分子，但仍不能完全解釋SACC嗜神經侵襲的機制，隨著“腫瘤微環境”學說的出現，學者們逐漸將其機制的研究回歸系統化，而不再考慮單一蛋白分子的作用。因此，為了更好地詮釋PNI的作用機制，需要有更多的相關蛋白質被發現和研究，以完善PNI的“侵襲相關系統”。
Virchow于1863年首先報告慢性炎癥與腫瘤之間存在密切的關系[4]。近幾年隨著炎癥因子與腫瘤之間關系研究的不斷深入，趨化因子與腫瘤轉移的相關研究越來越受到人們的重視。申志遠等[5]通過對臨床病理標本的研究發現：趨化因子受體CCR5在人SACC組織中高表達，且與SACC的嗜神經侵襲性密切相關。本研究旨在以前期病理標本研究為基礎，通過細胞實驗觀察趨化因子CCL5/CCR5生物軸對SACC細胞系SACC-LM的趨化性和侵襲性的作用，為CCL5/CCR5生物軸在SACC的PNI中的作用研究提供進一步的理論依據。
1，材料和方法
1.1 實驗材料
兔抗人多克隆抗體和CCL5酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒、FITC標記的熒光二抗（PeproTech公司，美國）；Transwell小室（Corning公司，美國）；Matrigel膠（BD公司，美國）；人重組活性蛋白CCL5（上海普欣公司）；羅丹明標記的鬼筆環肽抗體（Sigma公司，美國）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
將人SACC細胞系SACC-LM（圖1）置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，37 ℃，5%CO2孵育箱條件下培養。術中頸淋巴組織清掃所得人周圍神經在無菌條件下采用組織塊法進行原代培養，僅收集細胞培養的上清液。
1.2.2 細胞免疫熒光法檢測趨化因子受體CCR5在SACC-LM細胞中的表達
將對數生長期的SACC-LM細胞接種至12 mm×12 mm的小方片上，孵育箱內孵育24 h，采用PBS清洗3次，4%的多聚甲醛進行固定15 min，PBS再次清洗3次，0.5%Triton X-100覆蓋細胞，37 ℃孵育10 min，PBS洗滌3次后孵育一抗，即采用1%的BSA將一抗稀釋至所需濃度（1︰100稀釋），滴加至小方片上將細胞覆蓋。置于4 ℃冰箱內過夜后次日37 ℃條件下復溫30 min，PBS洗滌3次，然后孵育熒光二抗工作液，將熒光二抗工作液滴加至細胞表面，37 ℃避光孵育2 h，PBS清洗3次，DAPI染色并置于37 ℃
避光環境下再次孵育15 min，最后避光條件下，PBS清洗3次后，將小方片置于熒光顯微鏡下觀察，以PBS代替一抗稀釋液組作為空白對照組。
1.2.3 流式細胞術檢測趨化因子受體CCR5在SACC-LM細胞中的表達
取對數生長期的細胞，棄培養液后用PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中和胰蛋白酶，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液后再加入含3%胎牛血清的PBS離心清洗1次，將細胞重懸后轉移至1.5 mL的EP管中，1 000 r·min-1離心5 min沉淀細胞后，加入100 μL一抗稀釋液（1︰100），置于37 ℃恒溫孵育箱中孵育30 min，PBS離心清洗2次，加入FITC標記的熒光二抗稀釋液，37 ℃孵育箱中避光孵育30 min，PBS離心清洗2次，4%多聚甲醛固定樣本。以未加一抗稀釋液組作為空白對照組。
1.2.4 ELISA法測定人周圍神經細胞原代培養上清液中趨化因子CCL5的含量
手術切取的周圍神經標本無菌操作下立即放于含有1 000 U·L-1雙抗液的培養基內，常溫下放置5 min。顯微鏡下去凈神經組織周圍的血塊及黏膜，用組織剪剪成約1 mm×1 mm×1 mm的小塊，貼于25 mL塑料培養瓶壁上，加入適量的含15%胎牛血清的DMEM培養液，37 ℃恒溫貼壁2 h后翻瓶并加入適量的培養液。細胞爬出后，PBS液清洗3次，加入無血清的培養液培養2 h，將培養液棄掉更換無血清培養液后培養12 h和24 h，并分別收集上清液。采用CCL5檢測試劑盒檢測樣品中的CCL5表達量。以新鮮的無血清DMEM培養液作為陰性對照，按試劑盒說明書進行操作。每個樣品ELISA法至少檢測3個孔，均數間的比較采用t檢驗。
1.2.5 流式細胞儀檢測SACC-LM細胞經CCL5處理前后細胞內F肌動蛋白量的變化
取對數生長期的細胞，棄培養液后用PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中和胰蛋白酶，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液后再加入含3%胎牛血清的PBS離心清洗1次，將細胞重懸后轉移至1.5 mL的EP管中，1 000 r·min-1離心5 min沉淀細胞后，加入濃度為100 ng·mL-1的CCL5無血清RPMI1640（200 μL），37 ℃孵育30 min后，離心洗滌2次，滴加羅丹明標記的鬼筆環肽抗體（1︰100稀釋）并重懸，37 ℃避光孵育30 min，利用流式細胞儀檢測熒光強度平均值。以加入無血清RPMI1640（200 μL）作為空白對照組。
1.2.6 劃痕實驗觀察CCL5對SACC-LM細胞運動能力的影響
將細胞以每孔2×105個的密度接種于24孔培養板中，待細胞長到單層完全融合時，用10 μL Tip槍頭在單層細胞上劃痕，建立細胞劃痕模型，并用PBS清洗2次。加入含CCL5（20 ng·mL-1）的無血清RPMI1640培養基，37 ℃孵育箱內繼續培養，用倒置顯微鏡于0、48 h觀察劃痕愈合程度。以單純加入無血清RPMI1640培養基作為空白對照組。
1.2.7 侵襲實驗觀察CCL5對SACC-LM細胞侵襲能力的影響
Transwell小室內為孔徑8 μm的多聚碳酸酯膜，用Matrigel膠（1︰5稀釋）包被后放置于專用的24孔細胞培養板內，選用對數生長期的SACC-LM細胞，血清饑餓12 h后，將細胞放于上室內，在下室中，加入600 μL含不同濃度趨化因子CCL5的無血清RPMI 1640培養液（0、10、20、50、100、300、500 ng·mL-1），并將培養板置于孵育箱內孵育12 h。每組設3個復孔，以在下孔中加入不含CCL5的無血清RPMI1640培養液作為空白對照組。取出嵌套小室，將上室多聚碳酸酯膜內面的細胞用棉簽擦凈，將膜底面的細胞用多聚甲醛固定，并用蘇木素和伊紅進行細胞染色，顯微鏡下讀取多聚碳酸酯膜底面穿過的細胞數目。統計學處理：于放大200倍光學顯微鏡下選取5個視野，記錄穿過多聚碳酸酯膜的細胞總數。
1.3 統計學分析
采用SPSS 13.0統計軟件包對所得數據進行統計學分析。P<0.05說明研究結果的差異具有統計學意義。
2 ，結果
2.1 細胞免疫熒光法和流式細胞術檢測趨化因子受體CCR5在SACC-LM細胞中的表達結果
細胞免疫熒光法和流式細胞術均發現SACC-LM細胞可以表達趨化因子受體CCR5（圖2）。
由圖2可見，在細胞免疫熒光實驗中，熒光顯微鏡下觀察趨化因子受體CCR5表達陽性的細胞，呈現出綠色熒光；利用CCR5抗體+流式細胞術同樣發現SACC-LM細胞有趨化因子受體CCR5的表達，其陽性表達率為81.9%。
2.2 ELISA測定結果
ELISA法測定人周圍神經細胞原代培養上清液中趨化因子CCL5的表達量為（359.2±15.8）、（696.4±22.6） pg·mL-1，均比空白對照組多（P<0.05）（圖3）。
2.3 流式細胞術檢測細胞內F肌動蛋白量的變化
加入趨化因子CCL5孵育30 min后，利用流式細胞儀檢測SACC-LM細胞內F肌動蛋白的熒光表達強度，進而反應細胞內F肌動蛋白量的多少。實驗組中F肌動蛋白的熒光表達強度為82.8%，明顯高于空白對照組（圖4）。
2.4 劃痕實驗和侵襲實驗結果
相同時間段內實驗組SACC-LM細胞劃痕模型的愈合速度明顯高于空白對照組（圖5）；侵襲實驗中，加入趨化因子CCL5后各實驗組穿越PC膜的細胞數目均有明顯上升，當趨化因子CCL5的濃度為20 ng·mL-1時，穿越PC膜的細胞數最多（圖6）。
3，討論
惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移是一個連續的、復雜的、系統性的過程，具有高度的特異性，雖然國內外學者已經證明惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移是一個多因素參與的過程，但不同組織學類型的惡性腫瘤進行特定的侵襲和轉移的分子機制尚不清楚。趨化
因子可以調控細胞的遷移，其與相應受體的結合可以引起細胞骨架蛋白的改變，使得細胞形成更多的偽足，進而促進了細胞的運動性，這是惡性腫瘤發生侵襲和轉移的前提條件[6-7]。隨著趨化因子研究的不斷深入，其在惡性腫瘤中的作用已經被多數
學者作為“腫瘤微環境學說”的重要機制之一。趨化因子CCL5，屬于CC趨化因子家族的成員，具有介導免疫細胞定向趨化的作用[8-9]，其受體有3個，分別是CCR1、CCR3和CCR5，其中以CCL5與CCR5的親和力最強，構成了CCL5/CCR5生物軸。國內外許多
學者[10-11]認為趨化因子CCL5和其受體CCR5在惡性腫瘤的侵襲和轉移中扮演著重要的角色。有研究[11-12]表明，趨化因子CCL5與前列腺癌、胰腺癌及乳腺癌的侵襲與轉移密切相關。研究[13-15]發現CCL5/CCR5生物軸可引起乳腺癌細胞內細胞骨架蛋
白的重排，使細胞的運動性增加，促進了癌細胞的浸潤與轉移。在筆者前期的實驗[16]中，發現CCL5/CCR5生物軸存在于人唾液腺SACC和周圍神經之間的“微環境”中，并且通過體外細胞實驗證明趨化因子CCL5可以明顯地促進SACC細胞的趨化和侵襲能
力，這說明CCL5/CCR5生物軸可能在SACC易侵襲周圍神經中起著重要作用。但是，CCL5/CCR5生物軸在SACC細胞嗜神經侵襲中的具體分子作用機制尚需進一步的研究。
綜上所述，本研究通過細胞免疫熒光技術證實了趨化因子受體CCR5在SACC-LM細胞中的存在，利用ELISA法檢測到了周圍神經細胞可以外分泌趨化因子CCL5。為了觀察趨化因子CCL5對SACC-LM細胞運動能力的影響，筆者通過流式細胞術檢測到趨化因子
CCL5促進了SACC-LM細胞內F肌動蛋白的增多，這是細胞運動性增強的標志之一；而后又在劃痕、侵襲實驗中，從宏觀角度觀察到了CCL5/CCR5生物軸對SACC-LM細胞遷移及侵襲能力的促進作用。以上結果說明CCL5/CCR5生物軸在SACC細胞嗜神經侵襲中可
能扮有重要的角色，有利于進一步研究唾液腺SACC嗜神經侵襲的機制。
來源：原創 李添翼 申志遠 華西口腔醫學雜志
