作者：徐欣，何金枝，周學東（通訊作者）
作者單位：口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院（四川大學），成都 610041
[摘要] 口腔微生物群落是指定植于人體口腔的微生物集合，多以生物膜形式行使微生物生理學功能。當微生物群落與宿主間生態關系失衡時，可誘發多種口腔感染性疾病，包括齲病、牙髓根尖周病、牙周病、智齒冠周炎、頜骨骨髓炎等，嚴重危害口腔健康。更為重要的是，口腔微生物群落與口腔腫瘤、糖尿病、類風濕性關節炎、心血管疾病及早產等系統性疾病緊密相關，口腔微生物群落結構特征可作為口腔及全身健康預警的重要標記。隨著“人類微生物組計劃”及其他微生物宏基因組學相關項目的開展，人們對口腔微生物群落的認識不斷深入，已獲得了海量大數據信息。在“后微生物組計劃”時代如何有效地將微生物群落大數據轉化為具有實際運用價值的臨床診療手段，進而為患者提供有效的個體化醫療服務將是推動口腔疾病乃至全身疾病“精準醫療”的重大前沿問題。本文擬從常見口腔及相關系統性疾病微生物群落研究進展入手，闡述口腔微生物群落信息在疾病發生、發展及預后預警中的作用，提出建立基于口腔微生物群落疾病預警系統的必要性，為實現口腔疾病及相關系統性疾病的個性化診療提供新的思路。
[關鍵詞] 口腔微生物群落；疾病預警；口腔感染性疾病；系統疾病；宏基因組學
從人體微生物組中尋找更加精準的疾病診療分子標記，是當前微生物學研究的國際前沿。人類自身的數十萬億細胞所攜帶的遺傳信息，構成了人類的“第一基因組”，而每個個體攜帶超過10 000種、總量數十億的微生物遺傳信息的總和構成了人類的“第二基因組”，即人體微生物組[1]。人類“第一基因組”及“第二基因組”共同決定了人體健康與疾病狀態。在人類基因組計劃完成后，美國國立衛生研究院（National Institute of Health，NIH）于2007年底啟動了針對“第二基因組”的“人類微生物組計劃”（human microbiome project，HMP），旨在通過繪制人體五大部位（口腔、鼻腔、陰道、腸道、皮膚）微生物基因組結構，解析微生物菌群結構變化對人類健康的影響[2]。人類微生物組計劃掀起了全球微生物組學研究熱潮，眾多國際頂級學術期刊先后發布了這一研究領域的階段性成果[3-6]。在HMP取得階段性成果基礎上，美國政府于2015年啟動了“全民個體微生物組檢測項目”，開展大規模人群微生物群落信息研究，旨在以口腔、皮膚及腸道微生物群落為主要研究靶點，將“人類微生物組計劃”的研究結果進行臨床轉化，從“第二基因組”中尋找更加精準的疾病預警分子標記。
1 口腔微生物群落是口腔及全身健康的重要標記
作為人體微生物群落的重要組成部分之一，口腔微生物群落因取材方便、與口腔及全身健康關系密切，成為HMP及“全民個體微生物組檢測項目”的重點關注對象。
口腔微生物群落是指定植于人體口腔的微生物集合[7]，這些微生物多以生物膜形式組成復雜群落，行使微生物的生理學功能。當與宿主處于平衡狀態時，口腔微生物群落可阻止外源性致病菌的入侵，發揮生理性屏障作用；當微生物群落與宿主間生態關系失衡時，可誘發多種口腔慢性感染性疾病，包括齲病、牙髓根尖周病、牙周病、智齒冠周炎、頜骨骨髓炎等，嚴重危害口腔健康。更為重要的是，口腔微生物可以作為病灶，與全身系統性疾病關系密切。
2 以監測個別“致病菌”為手段的臨床策略未能有效進行疾病防治
傳統“致病菌”理論指導下的疾病診療策略并未有效降低齲病、牙周病的發病率，在一些地區和人群中甚至出現了逐年上升的趨勢。第三次全國口腔健康流行病學調查顯示，齲病發病率在5歲兒童達66.0%，成年人達88.1%，老年人則高達98.4%；牙周病患病率成年人高達80%~97%[8]。由于齲病、牙周病與全身系統性疾病之間存在密切聯系，上述口腔常見疾病患病率居高不下也增加了人群罹患糖尿病[9]、冠心病[10]、類風濕性關節炎[11]、中風[12]、肥胖[13]、動脈粥樣硬化[14]、早產及低體重新生兒[15]的風險；因此，建立更為全面、科學、有效的疾病預警系統，實現口腔疾病及相關系統性疾病的個性化診療，是有效防治口腔感染性疾病及口腔相關全身性疾病的迫切要求。
3 基于微生物群落整體信息的研究為口腔感染性疾病及相關系統性疾病預警提供了新思路
簡化論的局限性促使學者們通過“整體論”來研究口腔微生物群落。隨著宏基因組學、宏轉錄組學、蛋白質組學等領域的快速發展，基于大數據組學思路的疾病研究策略變得具有可操作性。近期的研究結果顯示，微生物群落改變是導致口腔多種感染性疾病的關鍵因素，根據群落信息有望對尚無臨床癥狀的高危人群做出早期預警；另外，口腔微生物群落結構與功能受到口腔及全身疾病狀態的影響，可作為上述疾病發展與預后的生物標記。
3.1 齲病相關研究
齲病發生過程中菌群組成和結構均發生了顯著改變；齲病的優勢菌不是單一的變異鏈球菌，而是由10個菌種共同構成的復雜細菌群落[16]；除變異鏈球菌外，韋榮菌屬、放線菌屬、顆粒菌屬、纖毛菌屬、硫單胞菌屬、雙歧桿菌屬、普雷沃菌屬等多種細菌均與齲病密切相關[17-20]；唾液菌群的結構和功能均可作為預測成人齲病發生的標記[21-22]。學者[23]發現兒童口腔不同位點菌群的結構和功能均可反映齲病情況，并首次提出了“齲病菌群指數”（microbial index of caries，MiC），根據該指數不僅可作為診斷口腔健康狀態的生物學指標，同時可在齲病臨床癥狀出現之前，預測齲病發生風險。
3.2 牙髓根尖周病相關研究
根尖周炎是發生于牙齒根尖周組織的感染性疾病，多繼發于齲病，根管治療是目前治療根尖周病最有效的方法；然而即使經過完善的根管治療，仍有4%~15%的患牙遷延不愈，發展成為難治性根尖周炎，表現為復發性根尖周膿腫和進行性骨質破壞，是牙髓根尖周病的巨大臨床挑戰。目前認為，難治性根尖周炎是以微生物感染為始動因子的多因素疾病，治療過程中未完全清理的根管內及根尖孔外生物膜，以及唾液污染帶入根管內導致的新感染在難治性根尖周炎的發展中具有重要地位。研究[24]發現，難治性根尖周炎根尖區微生物的變異度較初次感染大，根尖區微生物可以在根尖孔外表面定植，造成繼發感染，成為難治性根尖周炎遷延復發的主要原因。目前在難治性根尖周區已檢測到包括產丙酸丙酸桿菌、牙齦卟啉單胞菌、中間普雷沃菌、口腔普雷沃菌、微小微單胞菌、牙髓卟啉單胞菌、具核梭桿菌及福賽斯坦納菌等在內的口腔微生物[24-26]；因此，根據根管充填前根管內微生物的組成對患者罹患難治性根尖周炎的風險進行評估，有針對性采取進一步的治療措施（如預防性倒充填等），對提高患者的生活質量及患牙保存率具有重要意義。
3.3 牙周病相關研究
與齲病類似，牙周病也是微生物群落結構與功能改變所導致的口腔感染性疾病。Griffen等[27]發現，牙周炎患者齦下菌斑中約有120種細菌豐度較健康人群上升，而53種細菌豐度下降。除牙齦卟啉單胞菌、齒垢密螺旋體和福賽斯坦納菌外，包括擬桿菌、隱藏真桿菌、牙髓卟啉單胞菌、棲牙普雷沃菌、微小消化鏈球菌、消化鏈球菌、齦溝產線菌、脫硫球莖菌、小桿菌、互養菌、齦溝螺桿菌等在內的多種細菌均被認為與牙周炎的發生密切相關[28-31]。筆者團隊前期研究[32]發現，牙周炎患者齦下菌斑微生物組成多樣性與健康人群明顯不同，39個細菌屬在健康及疾病人群間差異性分布；牙周炎患者微生物群落功能基因發生明顯改變，且毒力因子、糖胺聚糖代謝及嘌呤代謝相關的編碼基因在牙周炎患者齦下菌斑中大量富集，而氨基酸合成相關基因呈現相反趨勢。學者[33-34]在比較分析口腔內不同生態位點菌群分布規律基礎上，根據口腔微生物群落信息建立了“牙齦炎菌群指數”（microbial index of gingivitis，MiG），該指數在41位志愿者的驗證群體中準確率達95%；他們還發現存在因菌斑組成不同而牙齦炎易感程度不同的兩類人群，以8個細菌屬構建牙齦炎微生物易感模型區分易感人群的準確率達74%。
3.4 口腔癌相關研究
口腔癌發病率在人類常見惡性腫瘤中排第6位，患者5年生存率低于50%，屬預后較差、毀容性疾病。找尋與口腔癌發生、發展及預后相關的分子標記，是提高患者生存率、改善生存質量的臨床重要問題。研究發現，口腔癌表面和癌體組織內存在著特異性微生物，其組成與正常黏膜微生物具有顯著差異。口腔癌患者唾液微生物中，機會性致病菌的豐度較健康人群顯著增加，不同腫瘤患者唾液微生物組的相似度較健康人群間更高[35]；因此，對口腔菌群的檢測可能成為鱗癌篩查的潛在方法。口腔微生物群落不僅可參與口腔癌的發生、發展，腫瘤的發生還可改變局部微環境，促進特定種類細菌在腫瘤表面及內部的定植；腫瘤的有效治療可通過糾正微環境促使微生物群落恢復到健康狀態[36]，提示通過檢測口腔微生物群落可對口腔癌的遠期療效做出早期判斷。
3.5 糖尿病相關研究
糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病可增加牙周炎的發病風險及嚴重程度，是牙周炎發生、發展的重要危險因素[37]。研究發現，1型糖尿病患者牙周炎部位牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線桿菌及彎曲菌屬檢出率較高[38]；2型糖尿病患者牙周炎部位牙齦卟啉單胞菌、假絲酵母菌屬檢出率高，而福賽斯坦納菌檢出率較低[39-40]。Casarin等[41]采用微生物群落16S rRNA高通量測序發現，2型糖尿病患者齦下菌斑中的菌群組成與非糖尿病患者間存在顯著差異，多種細菌在兩者間出現差異性富集。這種微生物群落的差異性富集可能與糖尿病人高血糖所導致的齦下菌斑微環境改變及宿主免疫系統破壞有關[42]，提示口腔微生物群落特征可作為反映該疾病狀態的潛在標志。
3.6 類風濕性關節炎相關研究
類風濕性關節炎是一種自身免疫性疾病，在全球范圍內影響數千萬人，并由于心腦血管等全身性并發癥導致大量患者死亡。微生物因素作為該疾病的激發因子之一，在疾病發生、發展中起著重要作用。近期研究發現，類風濕性關節炎患者的口腔微生物群落與健康人相比存在顯著失調，這種生態失調可通過類風濕性關節炎的治療而恢復，且恢復程度與患者對治療的反應密切相關；進一步根據口腔及腸道微生物菌群元基因組關聯分析，構建人群分類診斷模型在區分健康人及類風濕性關節炎患者的診斷準確率接近100%[11]，提示口腔微生物群落對全身疾病的發生、發展及預后具有極高的敏感性，可根據機體疾病的恢復情況進行適應性調整。
3.7 心血管疾病研究
幾乎所有的動脈粥樣硬化斑塊中均可檢出卟啉單胞菌、韋榮菌及鏈球菌；而口腔牙周袋內梭桿菌、鏈球菌、奈瑟菌的分布水平更是與動脈粥樣硬化的危險信號如血漿膽固醇水平相關。目前認為，口腔菌群可通過其表面膠原樣分子及血小板凝集相關蛋白促進血栓形成；革蘭陰性菌釋放的脂多糖，可通過刺激宿主釋放免疫調節因子與T細胞受體結合或與內皮細胞結合促進動脈粥樣硬化斑塊的發生[43]。此外，口腔菌群的毒力因子如菌毛、內毒素等可通過牙周組織破壞造成上皮屏障缺損，進入血液循環并影響血管內皮細胞功能，導致內皮功能紊亂、動脈粥樣硬化等疾病。因此，口腔微生物群落參與了心血管疾病的發生發展，可作為了解該疾病的重要窗口。
3.8 早產相關研究
盡管早產原因尚不明確，但妊娠期內感染被認為是早產的相關因素。對胎盤微生物樣本測序研究表明，與陰道、腸道、呼吸道等位點相比，胎盤微生物群落組成與口腔最相似[43]。將人唾液和齦下菌斑分別注射入鼠尾靜脈中，發現胎盤中定植的細菌多為奈瑟菌、消化鏈球菌、毗鄰顆粒鏈球菌、惰性聚集桿菌、鏈球菌及韋榮菌等口腔共生菌[44]。此外，在產婦的羊水中還檢測到了伯杰菌，其16S rDNA序列與產婦齦下菌斑中的一致，而在陰道等處并未檢出，提示伯杰菌可能與早產相關[45]。其他口腔細菌，如二氧化碳嗜纖維菌、單核細胞增多性李斯特菌、福賽斯坦納菌、齒垢密螺旋體、微小消化鏈球菌、血鏈球菌、口腔鏈球菌及伴放線放線桿菌等也在羊水中被相繼檢出[46]，提示口腔細菌可能更容易定植于胎盤，其毒力因子在胎盤局部產生病理效應從而誘發早產。Offenbacher等[47]在20世紀90年代首次報道了牙周病與早產的相關性。牙周炎癥主要可通過兩條途徑對妊娠結局產生影響：1）牙周疾病可導致宿主炎性因子，如白細胞介素（interleukin, IL）-1β、IL-6、基質金屬蛋白酶、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等上升，導致早產[48]；2）某些細菌成分（如脂多糖）也可在牙周炎時入血，刺激羊膜絨毛膜產生前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和TNF-α，造成胎膜破裂，引發早產[49]。臨床研究發現，有效的牙周治療可以降低局部及全身炎癥細胞因子的含量，延長孕期，降低早產的發生率[50]。也有研究[51]指出，牙周病與低出生體質量、子癇、流產等有一定聯系，但與早產的關系并不明確。筆者認為，妊娠期婦女在激素水平變化的作用下，口腔局部組織對菌斑等局部刺激因素的反應性增強，炎癥反應隨之增強，炎性細胞因子、激素及其他刺激物釋放入血引起宮頸成熟和功能性雌激素撤退，就有可能誘發早產。
綜上所述，口腔微生物群落結構與功能信息在預測疾病的發生及治療預后方面具有巨大潛能；基于口腔微生物群落生物學大數據，建立基于微生物群落整體信息的預警系統，是防治口腔感染性疾病及相關全身系統疾病的有效手段。
4 基于微生物群落信息的臨床診療尚面臨諸多技術瓶頸
在HMP等微生物宏基因組學研究項目推動下，利用高通量測序技術，對口腔微生物群落的認識得以不斷深入，并獲得了海量大數據信息。如何有效地將生物學大數據轉化為具有實際運用價值的臨床診療手段，進而為患者提供有效的個體化醫療服務尚有大量問題亟待解決，成為了制約后續轉化研究的關鍵。
4.1 臨床樣本采集的標準化
口腔微生態系作為僅次于腸道微生態系的復雜系統，其不同生態位點內微生物群落物種組成及基因種類均存在顯著差異，這種差異不僅與宿主的健康及疾病狀態相關，同時受到宿主年齡、性別、牙列狀態、民族、居住區域等遺傳及環境因素的影響。課題組前期通過各種高通量分析技術，發現口腔典型微生態境內細菌的分布模式存在顯著差異。厚壁菌為唾液及頰黏膜的優勢菌門，而變形菌、厚壁菌、擬桿菌及梭桿菌為齦上菌斑優勢菌門；口腔細菌組成隨著人的年齡及牙列狀態改變呈現波動狀態，頰黏膜菌群中螺旋體的豐度隨著年齡的增長而呈現遞增趨勢[52]。上述研究結果提示，樣品采集過程中是否細致化、部位是否細分化、采集對象年齡是否個性化將對檢查結果準確性產生重要影響；不同研究單位之間樣本采集流程是否標準化可嚴重影響數據的可比性及重復性。
4.2 微生物群落大數據分析流程的標準化
目前對微生物群落高通量測序所產生的大數據進行質控、物種生物學歸類、豐度及物種間進化關系分析，并基于群落結構對基因功能進行預測均耗時較長；因而，是否能減低測序成本、優化分析流程，同時獲取對疾病預警的高特異性、高靈敏度微生物群落信息是基于口腔微生物群落的個性化疾病預警服務能夠大規模開展的重要因素。
4.3 橫斷面研究結果需在前瞻性研究中進一步檢驗
人群橫斷面研究所獲得群落差異原因復雜，可受到個體間遺傳差異、菌群隨機變異等因素干擾，獲得的健康與疾病組之間的菌群差異圖譜可信度和準確性較低。更重要的是，單純的橫斷面研究僅能提示微生物群落改變與疾病發生的相關性，并不能明確微生物群落與疾病發生的“因果關系”。疾病的發生、發展是一個緩慢過程，宿主和微生物在疾病的不同發展階段均具有顯著的異質性，基于前期橫斷面研究所獲取的微生物群落與疾病相關性信息亟待前瞻性的臨床研究驗證，以明確核心微生物菌群與疾病的“因果關系”，并通過對人群的追蹤隨訪，驗證、調整、完善基于口腔微生物群落信息的疾病預警閾值與效能。
5 建立國人口腔微生物群落疾病預警系統，實現疾病個體化診療
以口腔微生物群落結構與功能為研究對象，采用系統生物學研究手段，建立基于口腔微生物群落大數據的口腔感染性疾病及系統性疾病預警系統，有望實現基于人類“第二基因組”的疾病精準醫療。加快開發集高效能宏基因組數據庫搜索、對比、分析、可視化等功能為一體大數據分析處理系統，深度整合當前已發布的各種口腔微生物群落大數據信息，可為構建疾病相關口腔微生物群落數據庫奠定基礎。另一方面，應充分利用國內豐富的臨床資源優勢和人才優勢，標準化志愿者臨床信息及生物學樣本的采集流程，完善疾病相關口腔微生物群落數據庫及標準化數據分析流程，進一步發現、驗證口腔微生物群落結構及其功能改變與人類健康及疾病狀態間的關系。通過前瞻性隊列研究，檢驗口腔微生物群落在疾病發生及治療預后中的預警效能，最終有望將微生物群落基礎研究結果轉化為預測疾病發生風險的新技術，為患者提供個性化早期風險預警及治療預后服務。
來源：《華西口腔醫學雜志》2015年12月第33卷第6期
