生物鐘基因對骨改建的影響
鄧旭亮
專家介紹：鄧旭亮，男，1972年2月生，北京大學口腔醫院科研副院長，特診科主任、教授、主任醫師，博士生導師，中國生物醫用材料產業技術創新戰略聯盟副理事長，生物醫用材料北京實驗室副主任，中國生物醫學工程學會生物材料分會理事。2016年入選科技部中組部“萬人計劃”，獲第七屆“全國優秀科技工作者”，獲第十一屆光華工程科技獎青年獎，2015年獲長江學者特聘教授，2014年度獲國家杰出青年科學基金資助，2013年獲選科技部中青年科技創新領軍人才，2013年作為第一完成人獲教育部 “高等學校科學研究優秀成果獎”技術發明二等獎，2009年入選教育部“新世紀優秀人才”計劃。近年來作為項目負責人主持了21項科研項目，其中國家自然科學基金項目6項、國家863項目4項、科技部國際合作項目、教育部新世紀優秀人才支持項目、衛生部行業科研專項課題、北京市科技計劃等，并作為主要完成人和學術骨干參加了國家及省部級科研項目14項。從口腔關鍵材料的臨床應用特點及存在的問題出發，在新型口腔樹脂基修復材料及引導組織再生支架材料的組成、結構設計、制備和功能仿生、納米效應發揮及組織修復機理等方面進行了長期基礎研究，獲得了多項重要的理論研究進展和應用參加成果。發表論文177篇，其中SCI收錄論文65篇，其中通信作者40篇（近五年44篇，其中通訊作者27篇），總被引用743次（SCI他引677次），單篇引用最高111次，申請25項國家發明專利（其中第一發明人申請7項），授權13項，獲國藥局Ⅲ類醫療器械注冊證3個，國內外學術特邀報告11次，其中含大會報告5次（國際2次，國內3次），已經指導碩士研究生25名，博士生7名。
摘要
生物體的生理、生化和行為的周期性震蕩稱為生物節律，由生物鐘基因調控。數十種核心鐘基因中，Clock和Bmal1最早被發現，并且作為整個時鐘體系的起始因子。而骨再生和改建是解決當今口腔醫學重要的前沿科學問題。因此本文以鐘基因和骨改建兩者關系為題，了解生物鐘基因的基本機制，以及生物鐘基因可能對骨改建造成的影響，初步探討Clock和Bmal1基因對再生和骨改建的調控機制，總結近年來生物鐘基因影響骨改建的研究進展。
1 生物鐘基因的特點
晝夜節律是持續運行并且以大約24 h為周期的生物節律，是生物體的生理、生化和行為的周期性震蕩，是所有生物體對可預測的環境改變的一種綜合性適應，這幾乎是所有真核生物和部分原核生物的基本特征［1］。從單細胞生物到人，從體溫的波動、激素水平的漲落、識別和記憶能力的變化等都呈晝夜節律性。而在日常生活中，最明顯的晝夜節律是睡眠-覺醒這一生理變化。有兩種機制精確地控制著睡眠和覺醒的時間：一是機體狀態平衡機制，即睡眠穩態調節；另一個是晝夜節律，即在24 h內，人體的生理機制會出現盛衰變化，從而調節睡眠時相［2］。這兩種機制的相互協調，影響著睡眠的時間點、長度、質量以及醒后人體的各種機能狀況，使得身體在需要時睡覺，在得到滿足后醒來［3］。
晝夜節律發生的結構基礎是分子計時器，即晝夜節律生物鐘，從哺乳動物到細菌的大多數生物體都有這樣一個計時裝置［4］。早在2002年，有研究發現在哺乳動物中，下丘腦的視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）是實現這一神經系統功能的重要核團，因而被稱為中樞生物鐘［5］。中樞生物鐘可以通過眼睛的特殊光感受器來感受外界環境明暗變化，再通過視網膜神經節細胞（非視細胞或視色素）將信息通過視網膜下丘腦束傳遞至SCN腹外側部即“視網膜-下丘腦信號通路”，從而導引位于SCN的主生物鐘的節律性振蕩，使輸出節律與太陽晝夜的變化一致。它使各種生命活動（如體溫、血壓、激素分泌量、骨發育等）每天有節律并且有序的表現出來。
隨著研究進展，截至2011年，人們已經發現10余個核心生物鐘基因，比如Clock、Bmal1、Pers、Cry、Tim、Tau等，這些核心生物鐘基因在細胞內互相作用，形成一系列的轉錄/翻譯的反饋環來調控彼此的表達量，從而使這些基因在恒定的光照-黑暗周期中呈現節律性的表達［6-7］。基因啟動子內的E-box序列（常規形式：CACGTG，非常規形式CACGTT等）是這些基因進行轉錄調控的目標［8］。核心鐘基因按其對基因轉錄的調控作用分為兩大類：Clock和Bmal1被歸為正向調控部分；Cry1、Cry2、Per1和Per2被歸為負向調控部分［9］。
2006年，研究發現生物鐘基因的分子運行機制大致是：Bmal1與Clock蛋白互為分子伴侶，二者相互結合成Bmal1/Clock異二聚體。Bmal1和Clock基因形成中心振蕩環的正向元件。Bmal1基因作為時鐘體系的起始因子，以Bmal1/Clock異二聚體的形式與靶基因啟動子的E-box元件結合，最常見的是與含有CACGTG核苷酸序列的E-Box之間有著高度親和力（也有CACGTT的非常規的表現形式），然后驅動3個周期基因（Per1、Per2和Per3）、2個隱花色素（Cry1和Cry2）和轉錄阻抑物REV-ERBA基因的節律轉錄，繼而Per和Cry蛋白形成復合體進入細胞核，抑制Bmal1/Clock二聚體的活性，構成反饋的負向環路，產生時鐘節律［10-11］（圖1）。
圖1 生物鐘基因的分子運行機制
隨著研究的進展，發現生物鐘基因的分子運行機制不僅存在于作為中樞的SCN中，在周圍組織（心臟、肝臟、腎臟、成纖維細胞和外周淋巴細胞等）也存在生物鐘基因的表達［12］，也同樣參與調解各種已分化細胞或干細胞內獨特生命活動的晝夜節律。生物鐘基因在細胞分裂、骨形成、能量代謝、腫瘤形成等多種重要生理過程中起到重要作用。周邊組織的生物鐘受到中樞生物鐘的嚴密調控。實驗表明，在SCN破壞的情況下，周邊組織的整體生物節律也逐漸消失［13］。因此，生物鐘基因在機體的平衡調控中起到關鍵作用。
2 生物鐘基因對骨改建的調控
骨骼系統是機體的主體系統，是一種高活性組織。骨骼系統的發生在胚胎早期就已經開始，但在之后的一生中還會不斷改建和更新，以修復自身微損傷、保持骨組織結構、行使負重等功能。研究表明，人類每年有10%的骨改建代謝重建，骨骼系統的內穩態平衡就是靠骨重建來實現的［14］。骨形成的過程包括兩種方式：軟骨內成骨和骨膜內成骨。對成年期的骨骼來說，骨形成只發生在骨缺損需要重建的位置。骨改建包括骨吸收和骨形成兩個方面，涉及到覆蓋在骨骼表面的骨襯細胞皺縮、破骨細胞填補位置，并將鈣化的基質吸收形成骨陷窩，以及成骨細胞進入骨陷窩重新充填新的骨質［15-16］。
近十年來，很多文獻表明了生物鐘基因與骨形成和骨改建存在著聯系。目前的研究大多還局限在小鼠模型上。生物鐘基因缺失在小鼠上不僅體現出明顯的晝夜節律紊亂，同時也伴有活動減少、體重減輕、生命延長等表現［17］。有研究顯示，將離體小鼠軟骨細胞培養于三維海綿中，通過對位于骨性關節炎軟骨細胞的細胞漿、細胞骨架、細胞核中的12 000多種基因的DNA微點陣分析發現：生物鐘基因Clock以及Per1、Per2在軟骨中均有表達，并呈現典型的晝夜節律［18］。
近些年的研究發現，生物鐘基因在骨細胞中也有表達，并且調控骨重建的過程。生物鐘基因Per1、Per2、Cry1、Cry2基因的敲除將會導致整個小鼠的骨體積變大，而不會造成身體組分的改變和其他明顯的代謝紊亂。Per2的功能性敲除導致雌鼠骨體積呈現年齡依賴性增長［19］。有研究也表明，在Per2-Brdm1突變小鼠中，骨形成速率大量提高，但是成骨細胞和破骨細胞的數量并沒有增加，可能主要是因為調節成骨細胞活性因子釋放的功能發生了改變［20］。在Cry2-/-小鼠中，成骨細胞的活性沒有明顯改變，但是破骨細胞的活性被降低，從而骨吸收的速率降低，導致這類小鼠有比較高的骨體積［21］，這與在Per2 Brdm1突變小鼠中觀察到的骨表性不同，進一步表明生物鐘基因在調控骨平衡中各自起著不同的作用。
1997年，Ikeda和Nomura研究小組首先命名了Bmal1。Bmal1基因又名Mop3、芳烴受體核轉位蛋白3（aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator 3，ARNT3）基因，是一種調節生物節律的重要轉錄因子，其表達產物Bmal1蛋白是正反饋環路的調節因子之一。Honma等［22］的進一步研究中，在人的基因組已得到的體外表達的小段序列中，發現了Bmal1基因是一段含有堿性螺旋-環-螺旋（PAS）結構域的基因序列，并成功的進行了克隆。
1999年，Takahashi研究小組發布了對人類Clock（hClk）的克隆結果，得到了人類cDNA 編碼的Clock蛋白。人類Clock蛋白編碼序列為2 538 bp，其中89%與小鼠類似；hClk定位于4號染色體長臂（4q12），含20個外顯子，其內含子、外顯子的組成也與小鼠一樣，這將是小鼠模型的實驗結果可能同樣適用于人的依據［23］。
2014年，在小鼠模型組織學水平的研究中發現，Clock基因敲除能夠促進骨密度的增加，同時引起骨小梁數量、厚度、骨體積比以及皮質骨厚度的增加，骨小梁間隔變小；Bmal1基因敲除導致骨密度的減少，同時引起骨小梁數量、厚度、骨體積比以及皮質骨厚度的減少，骨小梁間隔變大。該實驗在細胞學水平上的研究認為：Clock基因促進骨的生長和發育主要是促進成骨細胞的分化和礦化；而Bmal1基因抑制骨的形成和發育主要從抑制成骨細胞的分化和礦化以及促進破骨細胞的增殖兩個方面［24］。
近年，可查到的文獻還僅限于Clock基因和Bmal1基因對骨改建的影響，而其他核心鐘基因對骨改建的影響還有待進一步研究。
3 生物鐘基因與血管生長的關系
文獻表明，血管內皮生長因子（VEGF）可以促進骨愈合及移植骨內成骨［25］。所以，生物鐘基因可能通過影響血管內皮生長因子表達等方式間接影響成骨。
血管的生長發育受到多因子的調控，如血管生成素1（angiogenin-1，Ang-1）可以穩定血管的生長［26］，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以促使血管出芽［27］。在這些因子的相互作用下，血管會以特定的方向出芽并逐漸進行生長，并且不斷的重塑最后形成復雜而有層次的血管網絡。
2012年，有研究證實脊椎動物體內的生物鐘基因可以對血管生長發育起到作用。在斑馬魚體內，Per2和Bmal1對依賴VEGF的血管新生中發揮相反的作用［28］。2015年，有實驗利用基因敲除的小鼠模型證實，Per1、Per2和Bmal1基因對正常發育階段的小鼠的脈管生長沒有明顯的作用。該研究認為，和斑馬魚模型產生差異的主要原因可能是：第一，在哺乳動物體內Bmal1和Per2可能依然可以調控VEGF的表達，但是調控幅度不足以引起明顯血管新生的缺陷；第二，哺乳動物體內存在更完善的代償機制，從而啟動其他信號通路平衡VEGF的表達，保證正常脈管的發育；第三，哺乳動物體內脈管生長的調控機制與斑馬魚相比更加復雜，而這種差異需要更進一步的研究和證據去說明［29］。
4 生物鐘基因與骨改建的研究展望
截至2016年4月24日在美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上的關聯詞查詢，可見近些年對于生物鐘基因（Clock gene）與骨改建（Bone remodeling）共同的研究還比較少（圖2）。目前生物鐘基因的研究大多是和腫瘤等疾病相關，而與調控生長發育的文獻較少。研究表明，機體內大約30%基因受生物鐘基因調控，所以我們可以猜想，骨的改建是與生物鐘基因息息相關的。
圖2 NCBI關于生物鐘基因與骨改建的相關研究統計（截至2016年4月24日）
研究表明，生物鐘大致是48 h節律的震蕩方式［30］，而骨的改建是一個長期動態的過程。我們可以猜想骨組織生長發育的節律性是受生物鐘節律的影響。但是人體長期骨組織生長研究中，標本采集是很難實現的，所以大多實驗都僅僅局限于細胞水平。但是對于完整人體，細胞節律性受到核心生物鐘基因的調控，單獨的體外細胞實驗難以說明其在機體中起到的作用。
當今，骨缺損的患者在口腔修復中很常見，如果能夠探究清楚生物鐘基因對骨改建的調控，就能通過調控生物鐘基因來獲得更好的骨改建治療效果。試想，如果我們可以通過調節飲食睡眠等每天的習慣，就可以提高修復骨缺失的治療效果，那么就可以對骨量不足患者的臨床治療起到很大幫助。關于生物鐘基因對骨改建影響機制我們還知之甚少，但隨著研究的深入，這些結果必定會成為我們修復缺損骨組織的重要研究依據。
信息來源：口腔醫學雜志
