來源：《華西口腔醫學雜志》2018年4月第36卷第2期
作者：孫同正1 滕飛2,3 賈松菠1 唐永平1 姜明1 黃適2 袁曉1 李曉嵐3 楊芳1,3
作者單位：
青島大學附屬青島市市立醫院口腔醫學中心，青島 266071；
2.中國科學院青島生物能源與過程研究所，青島 266100；
3.中山大學廣東省口腔醫學重點實驗室，廣州 510055
[摘要] 目的 通過高通量測序技術研究重癥低齡兒童齲病和健康者唾液的菌群結構及其差異。方法 在青島市嶗山區兒童中，經口腔檢查選取健康（H組）和重癥低齡齲病（C組）兒童各24名，采取唾液樣本，提取其DNA進行聚合酶鏈式反應擴增，利用454測序平臺對16S rRNA V1—V3區進行雙端測序，對細菌群落結構及多樣性進行差異分析。結果 C組唾液菌群物種豐度高于H組（P<0.05），兩組唾液菌群結構的差異有統計學意義（P<0.01），且C組的群落結構更為相似和保守（P<0.001）；鑒別出C組高表達的可疑致齲微生物（P<0.1）及H組高表達的健康相關微生物（P<0.1）；基于唾液菌屬圖譜建立的齲病風險評估模型區分健康和齲病者的準確率可高達70%以上。結論 唾液菌群和特定細菌種類，如比例升高的Prevotella菌屬有助于評估和篩選低齡兒童齲病風險。
[關鍵詞] 低齡兒童齲； 口腔菌群； 唾液； 元基因組學
開 篇
齲病是發生在牙齒的慢性感染性疾病，其中低齡兒童齲（early childhood caries，ECC）是影響兒童口腔健康的最主要的慢性疾病之一[1]。ECC不僅影響兒童期口腔健康，還可以引發一系列的感染和疼痛，嚴重影響患者的生活質量[2-3]。世界衛生組織對186個國家的人群口腔健康進行長達20年的縱向調查，結果顯示：在大部分國家，齲病仍影響著60%~90%的學齡兒童[4]。因此，針對齲病的病因學研究、風險評估乃至預防策略都是當今研究的重點問題[5]。
人類與其體內共生的微生物（即共生菌群，亦稱人體微生物組）共同組成一個超級生物體，而口腔的健康與疾病狀態依賴于宿主與口腔微生物群落之間的相互作用[6]。齲病四聯因素學說認為，細菌、環境、宿主、時間均是齲病發生的必要條件，細菌是其中一項重要環節。2000年以來，獲得越來越多學者認同的“生態菌斑假說”[7]亦為齲病的微生物病因學研究提供了新切入點。口腔菌群是人體內最復雜的微生物群落之一，其中絕大多數微生物不可培養[8]。由于技術手段和分析策略的局限性，極大地限制了對齲病根源進行全面而精準地解析。近年來，人類微生物組學計劃的深入開展和高通量測序技術的迅猛發展為口腔菌群研究提供了前所未有的嶄新視野，同時為齲病的微生物病因學的深入認知帶來了新契機。
本研究采用新一代的高通量生物技術（454 GS FLX Titanium）并結合多元統計分析手段，旨在全面解析口腔唾液微生物群落的生態特征，并對重癥低齡齲兒童及健康兒童的唾液菌群進行相互比較分析，探討可能的參與齲病發生發展的微生物因素。
1、材料和方法
1.1 樣本采集
1.1.1 采樣對象的選擇 2016年4—5月對青島市嶗山區幼兒園兒童進行口腔檢查，篩選出24名重癥低齡兒童齲（severe early childhood caries，S-ECC）兒童（C組）和24名健康兒童（H組）參與本研究。C組兒童要求齲失補牙指數（decayed, missing, and filled teeth，dmft）≥10，H組要求dmft=0；兩組兒童年齡均在4歲左右，其中男24名（健康和疾病人數的比例為1∶1），女24名（健康和疾病人數的比例為1∶1）。所有兒童要求檢查前1個月未服用抗生素，口唇黏膜顏色、質地均未見異常，沒有發育畸形及全身性疾病等先天疾病，近1個月內未佩戴口腔活動矯治器。整個實驗流程各項細節及以后的數據發表均得到青島大學醫學倫理委員會批準，同時征得兒童監護人同意。
1.1.2 樣本采集方法 口腔檢查：由兩名牙體牙髓?？漆t生以視診結合探診的方式進行檢查，檢查器械均經高溫高壓嚴格滅菌消毒。在檢查前統一認識、方法和標準，標準一致性檢驗的Kappa值均大于0.83。采用世界衛生組織《口腔健康調查基本方法》（1997年）對齲病的診斷標準診斷齲病。
唾液收集：篩選進入研究的兒童取樣前一晚及當天早晨不刷牙，上午9時進行樣本收集。取樣時，囑兒童把自然、未受刺激的唾液緩慢吐入無菌50 mL離心管中，持續5 min，對樣品分別編號，封口至4 ℃采樣樣品保存箱，置于-80 ℃冰箱中保存。
1.2 基因組DNA提取、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增及測序
采用DNeasy® Blood and Tissue kit（Qiagen公司，美國）試劑盒純分離樣本中基因組DNA，定量測定其濃度，檢測純度，并電泳檢測DNA完整性，保存于-80 ℃。選取16SrRNA片段上V1—V3高變區（Escherichia coli positions 5—534）作為擴增目標片段進行PCR擴增。按照Qiagen MiniElute試劑盒提供的操作流程進行回收并純化目的片段DNA，溶解于20 μLTE液洗滌[9]，利用454 GS FLX Titanium平臺進行雙端測序。
1.3 數據分析
利用本實驗室已經建立的454高通量序列處理流程，利用MOTHUR（https://www.mothur.org/）軟件對得到的原始序列進行質量控制[9]。
1.3.1 群落結構分析 基于操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）結果計算物種豐度估計指數（Chao1）及物種多樣性指數（Shannon和Simpson），以展示口腔唾液菌群的α多樣性。通過計算任意兩個樣品的Bray-Curtis距離，構建Bray-Curtis矩陣并進行主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA），以展示C組和H組間的物種結構特征（β多樣性）。
1.3.2 物種的種系發育信息分析 從門到種水平進行細菌種系信息劃歸。利用RDP Classifier分類工具，比對Greengens數據庫（http://greengenes.secondgenome.com/），選取置信度0.8為臨界閾值，低于該臨界值即列為未分類細菌，并計算每個門類各物種的相對豐度。
1.3.3 統計學分析 所有統計分析采用R（Version 3.2.1）軟件包進行。兩組間比較采用Wilcoxon ranksum檢驗，多重比較采用Bonferroni檢驗校正（P<0.1認為差異具有統計學意義）。采用多因素方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）檢測疾病狀態和性別對菌群結構的影響程度。所用模型算法為機械學習的隨機森林（random forest，RF）法，預測能力通過受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）分析，模型區分能力則利用ROC曲線評估（area under the curve，AUC）進行分析。
2、結果
采用多樣本平行標記技術對兒童口腔唾液樣品進行分析，得到約400 bp長的序列。經初步篩選，共獲得270 395條序列，每個樣品平均得到5 634條序列。
2.1 基于OTU的菌種多樣性分析
由圖1可見：H組與C組的Shannon和Simpson指數無明顯差異（P>0.05），但兩組的Chao1指數差異有統計學意義，且C組明顯高于H組（P<0.05）；不同性別的α多樣性指數的差異均無統計學意義（p>0.05）。
2.2 基于Bray-Curtis的群落結構特點
H組和C組唾液微生物群落結構見圖2。首先，齲病狀態會顯著影響唾液菌群結構（F=2.76，P<0.01），而性別對唾液菌群結構沒有明顯影響（p>0.05，圖2左）；其次，H組和C組的菌群結構存在差異（P<0.01），且C組兒童的群落結構更為相似和保守，而H組則相距較遠且更為分散（P<0.001，圖2中）；最后，進一步通過距離矩陣進行PCoA分析，可以在P1主坐標看到兩組人群的分離趨向（P<0.01，圖2右）。
2.3 基于種系發育信息的群落特點
對H組和C組唾液的菌群微生物相對豐度進行比較分析，結果見圖3。在細菌門水平，兩組樣品的組成成分都較為近似，超過99%的群落成員由以下6個優勢細菌門構成，包括厚壁菌門（Firmicutes，42.55%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，24.50%）、變形菌門（Proteobacteria，16.76%）、放線菌門（Actinobacteria，9.51%）、梭桿菌門（Fusobacteria，4.94%）、TM7（1.18%）；但H組和C組在門水平上的物種組成無明顯差異。
在門、綱、目、科、屬、種6個分類水平，分別對不同性別來源和不同疾病狀態的人群進行比較，未發現性別相關的細菌種類；在H和C組間比較，未發現齲特異性細菌種類（單獨存在于某一方人群，而另一方人群中缺失），但從綱到屬4級水平均檢測到相對豐度存在顯著差別分布的細菌種類（圖4）。
由圖4可以總結出兩組高表達的微生物。1）C組高表達的微生物，即可疑致齲微生物（P<0.1）：擬桿菌綱（Bacteroides）、擬桿菌目（Bacteroidales）
、普氏菌科（Prevotellaceae）以及普氏菌屬（Prevotella）；2）H組高表達的微生物，即健康相關微生物（P<0.1）：黃桿菌綱（Flavobacteria）、黃桿菌目（Flavobacteriales）、黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、棒狀桿菌科（Corynebacteriaceae）、伯杰菌屬（Bergeyella）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）和鏈球菌組（Streptococcaceae Group）。
2.4 利用唾液菌群建立S-ECC兒童齲病的評估模型
基于S-ECC兒童齲病時口腔菌群表現出明顯改變的結果，筆者利用RF法基于唾液菌群種系發育屬水平上的全部物種以及篩選出來的4個潛在的齲病生物標記物 （Prevotella、Bergeyella、Corynebacterium、Streptococcaceae Group）建立評估模型，結果見圖5。由圖5可見，基于所有唾液細菌屬信息建立的齲病評估模型（圖5左，AUC=0.88，準確率為0.79）區分健康和齲病的性能略優于基于4個細菌屬信息建立的評估模型（圖5右，AUC=0.78，準確率為0.73），提示該細菌屬作為低齡兒童齲病風險評估模型具有應用潛能。
3 討論
首先，本研究考察了S-ECC兒童和健康兒童的唾液菌群物種多樣性差異，發現兩組的物種多樣性指數Shannon和Simpson均無差異，這與之前的研究結果一致[10-12]；但C組的唾液菌群物種豐富度（Chao1指數）顯著高于H組，提示口腔的齲病狀態與唾液微生物的物種豐富度存在一定關系，但其原因還有待后續進一步驗證。
其次，通過考察健康組和齲病組的唾液菌群結構差異，發現齲病狀態是影響菌群結構變異的最重要因素，且H組和C組菌群結構具有明顯區分性，說明齲病的發生并不是某種特異性微生物的作用結果，而是口腔生物膜菌群結構整體發生的改變，這亦與“生態菌斑假說”的理論相一致[7]。特別的是，H組樣本彼此間變異較大，而C組樣本間唾液菌群相對保守度高，這提示齲病的發生模式可能較為一致。值得注意的是，既往的兒童齲病縱向研究[9]和成年人齲活躍者元基因組學研究中[6]亦發現健康和齲病者菌群結構上存在顯著差異，但在低齡兒童齲病的橫斷面研究[10-12]中較難檢測到。本研究發現差異的可能原因是研究對象均為重癥齲病者（dmft≥10），兩組的口腔健康狀態表型差異較大，且采用了較為靈敏的多元統計學方法。這一結果提示，當無法進行縱向實驗設計剔除個體背景干擾因素時，選取疾病狀態較為嚴重的極端樣本可較易挖掘疾病發生的一定內部規律。
然后，對于種系發育信息的結果，本研究得出的主要細菌門構成與既往關于兒童口腔牙菌斑的研究[10-11,13]相互驗證，但在兩組人群中無明顯差異。本研究未發現有該類“齲特異性”細菌存在，但觀察到在兩組人群中豐度存在顯著差異的“齲相關性”細菌種類。在細菌屬水平，S-ECC者檢測到顯著增加的（增加約7%豐度）Prevotella屬，且發現此屬的更高級分類亦在S-ECC組中高表達，包括綱水平上的Bacteroides，目水平上的Bacteroidales，科水平上的Prevotellaceae。Prevotella為無芽孢革蘭陰性厭氧桿菌，體外培養時缺乏致齲相關的產酸特性，僅具備中度耐酸能力[14]，并非常規意義上講的致齲性較強的細菌，如Streptococci mutans或Lactobacilli等[15]；但是其他一系列依賴相同或者不同技術手段的齲病菌群研究[9,16-17]也有類似結果，即發現Prevotella與齲病關系密切。Simón-Soro等[18]發現，在牙本質齲樣品中膠原酶過量表達，而該基因主要來源于升高的Prevotella屬，提示Prevotella可能并非通過傳統的致齲特性（產酸、耐酸等）參與了牙體組織脫礦而誘發齲病，而是潛在性地通過自身的蛋白溶解特性參與了齲病發展這一過程。
最后，齲病風險評估已經成為了當今齲病研究的一個重點問題，也是現代齲病防治的重要組成部分[5]。本研究基于唾液菌群細菌屬和篩選的4個菌屬，分別建立了齲病風險評估模型，區分健康和齲病樣品的準確率均可以達到70%以上；特別是基于篩選的4個微生物因子的齲病評估模型與基于全菌譜的齲病評估模型性能較為相似，這一結果提示可以利用這4個菌屬建立快速、準確而便捷的齲病風險評估方法。
[參考文獻]（略）
詳見《華西口腔醫學雜志》2018年4月第36卷第2期
