來源：《華西口腔醫學雜志》2017年4月第35卷第2期

作者：章可可，周學東，徐欣

作者單位：口腔疾病研究國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床研究中心，四川大學華西口腔醫院，成都610041

[摘要]  過氧化氫（H2O2）作為口腔中一種重要的抑菌物質，在口腔微生態平衡中發揮著重要作用。在口腔齦上菌斑定植的先鋒菌中，約有80%細菌屬于口腔鏈球菌屬，這些口腔鏈球菌可以利用不同的氧化酶合成H2O2，同時H2O2可通過抑制對H2O2敏感的微生物參與菌間競爭拮抗，使氧耐受菌得以存活，從而調節生物膜的發展過程；H2O2還可通過影響微生物細胞外DNA的釋放和感受態細胞的形成進而影響基因的水平轉移，調節生物膜對口腔環境的適應能力；同時口腔微生物也可通過一系列機制耐受H2O2。此外，H2O2在微生物與宿主的關系中也發揮著重要作用。本文就口腔中H2O2的來源及其在口腔微生態平衡的作用兩方面的研究進展進行綜述。

口腔是一個復雜的微生態系統，過氧化氫（H2O2）是這個復雜生態系中一種重要的非特異性抗菌物質。H2O2可由乳桿菌和牙菌斑早期定植的鏈球菌產生，也可來源于宿主，在調控微生態平衡中發揮重要作用。H2O2可通過抑制對其敏感的微生物參與微生物間的競爭拮抗，使得對H2O2較為耐受的細菌獲得競爭優勢，從而在生物膜形成過程中，特別是在生物膜形成初期發揮重要的菌群調節作用。H2O2可通過介導細胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）的釋放，參與細菌間基因的水平轉移[1]，影響生物膜對口腔復雜環境的適應能力；口腔內微生物也可通過一系列耐受機制減少H2O2對自身的傷害[2-3]。此外，H2O2在微生物和宿主的交互關系中也發揮著重要作用[4-5]。本文就口腔中H2O2的來源及其在口腔微生態中的作用進行綜述。

1  口腔中H2O2的來源

口腔中的H2O2主要來源于細菌和宿主[6]。乳桿菌和口腔鏈球菌很早就被發現可以產生H2O2[7-8]。定性和定量研究[9-12]發現，口腔鏈球菌、緩癥鏈球菌、表兄鏈球菌、血鏈球菌、戈登鏈球菌、寡發酵鏈球菌、副血鏈球菌等均能產生H2O2。這些鏈球菌均可以從人口腔牙菌斑中分離，且在牙菌斑中具有較高豐度[13]。體外實驗[8-9,11]表明，細菌H2O2的產生與其培養環境條件密切相關。口腔細菌主要依賴丙酮酸氧化酶[14]、乳酸氧化酶[15]、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）氧化酶[16]和L-氨基酸氧化酶[17]等途徑來產H2O2。

1.1  丙酮酸氧化酶途徑

血鏈球菌和戈登鏈球菌依賴丙酮酸氧化酶產生H2O2，該酶由spxB基因編碼，可催化丙酮酸鹽、無機磷酸鹽和氧分子生成H2O2[14,18]。研究者通過構建血鏈球菌和戈登鏈球菌的spxB基因的突變株和spxB基因的補償菌株，并比較了野生株、spxB基因突變株及spxB基因補償株與變異鏈球菌的競爭關系，證實spxB基因編碼丙酮酸氧化酶合成H2O2是血鏈球菌和戈登鏈球菌與變異鏈球菌細菌間相互競爭的重要分子機制[14]。

血鏈球菌和戈登鏈球菌H2O2的產生受細菌生長環境影響和自身相關基因的調控。Barnard等[11]系統研究了外環境因素對戈登鏈球菌H2O2產生的影響，結果發現，培養基中葡萄糖和蔗糖、金屬離子、pH、細菌生長期和氧分壓均會對戈登鏈球菌H2O2合成造成顯著影響。當培養基中蔗糖、葡萄糖含量有限時（0.1 mmol·L-1左右），戈登鏈球菌產生H2O2和乳酸的能力相當，而當培養基中蔗糖和葡萄糖較為富足時，H2O2合成顯著減少。由于口腔中的各種碳源代謝底物有限，戈登鏈球菌為了獲取有限的生存空間和營養，可能通過產生H2O2來抑制其他H2O2敏感菌的生長，進而在生物膜群落中獲得生長優勢。Zheng等[19]發現，戈登鏈球菌中的分解代謝物控制蛋白CcpA可結合到spxB的啟動子，抑制spxB基因表達，從而調控戈登鏈球菌H2O2的合成。

血鏈球菌H2O2的合成也受到一系列基因的調控。Zheng等[20]研究發現，血鏈球菌分解代謝物控制蛋白CcpA同樣能調控spxB的表達，血鏈球菌ccpA突變株spxB表達量較野生株上調約6倍，提示血鏈球菌CcpA也可通過抑制spxB基因的表達調控H2O2的產生。與戈登鏈球菌不同的是，血鏈球菌spxB的表達受培養基中葡萄糖含量的影響并不顯著，推測血鏈球菌CcpA蛋白依賴抑制作用受到其他代謝物（例如輔脫氫酶Ⅱ）的控制。Chen等[21]通過突變血鏈球菌全局性調控因子編碼基因spxA1和spxA2，研究了這兩個基因對血鏈球菌H2O2產生的影響。研究發現，spxA1突變株H2O2產量顯著減少，spxA1補償株H2O2的產生約為野生株的80%，但spxA2突變株H2O2的產量與野生株相比無明顯差異，提示血鏈球菌的全局性調控因子SpxA1參與控制spxB的表達，而spxA2對該細菌H2O2的產生無明顯影響。Chen等[22]另一研究表明，血鏈球菌ackA、spxR和tpk三個基因的突變株與野生株相比，產H2O2明顯減少。ackA和spxR的突變株中spxB的表達量減少而tpk的突變株中spxB的表達量增多，推測ackA和spxR可能為spxB表達的正調節基因，而tpk為spxB表達的輔因子。Zhu等[23]設計spxB通用引物對口腔菌斑spxB的動態表達進行定量檢測，結果發現，個體菌斑中spxB的表達量隨時間的改變相對穩定，提示spxB在口腔菌斑中具有功能性作用。

1.2  乳酸氧化酶途徑

寡發酵鏈球菌除可通過丙酮酸氧化酶合成H2O2外[15]，還可通過乳酸氧化酶參與H2O2的合成。Tong等[10]發現，寡發酵鏈球菌可通過乳酸氧化酶利用變異鏈球菌產生的乳酸合成H2O2。在細菌生長的不同周期，主要負責合成H2O2的基因不同。丙酮酸氧化酶主要負責細菌生長潛伏期和對數期H2O2的產生，而乳酸氧化酶主要負責細菌生長平臺期H2O2的合成。

1.3  NADH氧化酶和L-氨基酸氧化酶途徑

Higuchi等[16]在變異鏈球菌耐氧菌株NCIB11723中分離純化獲得了可產生H2O2的NADH氧化酶Nox-1。該酶由4個相對分子質量約為5.6×104的亞基組成，黃素腺嘌呤二核苷酸可促進該酶H2O2合成活性。Tong等[17]發現，寡發酵鏈球菌乳酸氧化酶Lox突變株在蛋白胨富集時對變異鏈球菌仍具有顯著抑制作用。進一步體外研究發現，氨基酸氧化酶LAAO可通過7種氨基酸產生H2O2，該蛋白編碼基因aaoSo突變株在上述氨基酸存在條件下也不產生H2O2，證實寡發酵鏈球菌還可通過氨基酸氧化酶LAAO合成H2O2。

1.4  宿主來源的H2O2

H2O2是活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）的一種[24]。宿主來源的H2O2可來自眾多途徑。線粒體可通過呼吸作用產生ROS，包括H2O2[25-27]。細胞內的清除系統有效地保護宿主免受ROS造成的傷害，其中產生的H2O2可能不會離開黏膜細胞，但這個途徑產生的H2O2的量大到足以在口腔微生態中發揮作用[5]。H2O2產生的另一個途徑來自巨噬細胞的氧化爆發。ROS的穩定產生（包括H2O2）是巨噬細胞氧化爆發的一部分，巨噬細胞產生的ROS是針對巨噬細胞外對宿主有侵害的病原菌，因此可以自由擴散到病原菌的附近[28]。但有研究[29-30]表明，個體巨噬細胞的含量處于一個逐日變化的過程，因此由巨噬細胞產生的H2O2量很難確定。Geiszt等[31]發現了另一種宿主產H2O2的途徑，他們發現表達雙氧化酶2的唾液腺細胞能持續地給唾液供應H2O2，并且產生的H2O2能直接隨著唾液進入到口腔中，這可能是唾液中H2O2的宿主來源的最主要途徑。

2  H2O2在口腔中的生物學作用

2.1  H2O2對生物膜的調節作用

H2O2可在牙菌斑生物膜形成初期影響微生物的早期定植。細菌的初始黏附在生物膜形成過程中具有重要作用。在初始黏附時，鏈球菌是主要的早期定植菌，通過特異性表面蛋白與唾液中蛋白結合，黏附定植于牙齒表面[32]。鏈球菌本身的表面蛋白也為其他口腔細菌提供了黏附和聚集的位點[33]。因此，初始黏附的細菌（主要是鏈球菌）為生物膜的成熟奠定了基礎。臨床研究發現，血鏈球菌與低齲風險相關[34-35]；寡發酵鏈球菌與齲病發生呈負相關[36]，提示在生物膜形成初期，早期黏附的鏈球菌可通過產生H2O2抑制齲病的機會致病菌（如變異鏈球菌）的生長和定植，對早期生物膜健康發展具有重要意義。

H2O2可通過對微生物的殺傷作用在生物膜形成過程中調節生物膜的組成。在生物膜形成過程中，細菌間的距離是一個重要因素[37]。Liu等[38]通過測量距戈登鏈球菌生物膜不同距離H2O2的濃度發現，在距生物膜表面100 μm處H2O2濃度為1.4 mmol·L-1，而在距離生物膜表面200 μm處H2O2的濃度為0.4 mmol·L-1。1.4 mmol·L-1是一個可以抑制H2O2敏感細菌的濃度，提示細菌產生的H2O2主要作用于那些與其相距較近的細菌。生物膜形成過程中H2O2濃度梯度的存在提示H2O2可通過對不同H2O2敏感性的微生物進行篩選，調節生物膜的組成。H2O2可穿過細菌細胞膜，對細菌的殺傷作用機制包括破壞細菌的酶活性或直接氧化細菌大分子（蛋白質和DNA）[39]。H2O2的氧自由基可與Fe2+發生反應，破壞對酶活性進行調控的鐵硫簇[4Fe-4S]結構[40]。此外，細菌細胞內H2O2的積累會導致在精氨酸、賴氨酸、脯氨酸及蘇氨酸殘基的側鏈中引入羰基引起不可逆的蛋白質羰基化，介導蛋白質的靶向降解[41-43]。

口腔細菌可以通過產生H2O2影響細菌eDNA的釋放和細菌感受態的形成，從而影響基因的水平轉移，進而調節生物膜對口腔多變環境的適應能力。口腔細菌為適應多變的口腔環境進化出了一系列的應對措施，包括基因的水平轉移[1,44-45]。接合、轉導和轉化是微生物基因水平轉移的3種形式[46]。轉化是處于感受態的細菌獲取eDNA進行DNA同源交換的過程[47]。通過同源交換，細菌可以獲取新的基因適應環境（如抗性基因、代謝相關基因等），同時也可修復突變的基因以維持其遺傳穩定性[48]。細菌eDNA的釋放依賴胞外細菌素、胞壁酸水解酶、胞內細菌素和H2O2等途徑[49]。Kreth等[14]發現，戈登鏈球菌和血鏈球菌染色體DNA的釋放與H2O2產生密切相關，SpxB缺陷株H2O2產生減少，染色體DNA的釋放也相應減少。Itzek等[50]研究發現，戈登鏈球菌在厭氧環境下H2O2合成降低，其染色體DNA的釋放也減少；在厭氧條件下加入H2O2會導致DNA的釋放增加。盡管H2O2導致細菌DNA釋放的具體機制尚不清楚，但該研究指出H2O2并不是通過介導細菌裂解進而促使DNA的釋放。細菌H2O2的產生也伴隨著細菌感受態的產生[50-51]，可以推測細菌在感知到H2O2所介導的DNA損傷后，可通過一些未知的分子機制釋放DNA并形成感受態細胞，通過轉化修復基因損傷與突變。

口腔微生物能通過一系列機制減少H2O2的損害。部分口腔細菌能利用過氧化氫酶減少H2O2對其的傷害。“戈登鏈球菌和內氏放線菌”是口腔細菌相互作用的經典研究模型，戈登鏈球菌可產生H2O2抑制內氏放線菌[52-53]。值得注意的是，戈登鏈球菌不能產生過氧化氫酶緩解H2O2對自身的傷害。Jakubovics等[3,53]發現，內氏放線菌可通過自身過氧化氫酶不斷消耗H2O2，從而減少H2O2對自身和戈登鏈球菌的傷害。另有研究表明，口腔細菌中的很多基因與耐受H2O2密切相關。“血鏈球菌和變異鏈球菌”以及“戈登鏈球菌和變異鏈球菌”是經典的口腔相互競爭研究模型，血鏈球菌和戈登鏈球菌主要產生H2O2抑制變異鏈球菌，而變異鏈球菌可產生變鏈素抑制血鏈球菌和戈登鏈球菌[14,54-55]。Xu等[2]分別觀察了血鏈球菌和戈登鏈球菌dps、trxB和sodA三個基因突變株對H2O2的耐受情況，發現血鏈球菌和戈登鏈球菌Dps突變株對H2O2極為敏感；血鏈球菌的TrxB的突變株和戈登鏈球菌SodA突變株對H2O2的敏感也顯著增加；而血鏈球菌SodA和戈登鏈球菌TrxB突變株對H2O2的耐受無明顯變化，提示戈登鏈球菌Dps和SodA及血鏈球菌Dsp和TrxB在相關細菌耐受H2O2過程中發揮了重要作用。另外，該研究還發現戈登鏈球菌比血鏈球菌更耐受H2O2，推測戈登鏈球菌在牙菌斑中的豐度較低，因此需要更強的耐受力進而在牙菌斑中獲得生長優勢。Zheng等[56]發現，與野生株相比，變異鏈球菌谷胱甘肽合成酶基因缺失株對H2O2更敏感；進一步通過血鏈球菌和變異鏈球菌雙菌種實驗證明谷胱甘肽合成酶在變異鏈球菌耐受H2O2過程中有重要作用。此外，產H2O2細菌為了減少H2O2對自身的傷害，可通過Mn2+代替[4Fe-4S]結構中的Fe2+，減少細胞內依賴鐵硫簇調控活性的蛋白質[57-58]。

2.2  H2O2在微生物與宿主交互關系中的作用

H2O2參與了微生物與宿主之間的交互作用。口腔微生物與宿主口腔細胞相互接近，微生物與宿主間存在頻繁的交互作用。微生物可產生對宿主有毒害作用的H2O2，對宿主造成損害。Ramsey等[59]發現，戈登鏈球菌產生的H2O2誘導伴放線菌嗜血菌表達基因katA和apiA，促使伴放線菌嗜血菌逃脫宿主的免疫系統。Okahashi等[60]發現，血鏈球菌可產生H2O2導致人類巨噬細胞死亡，抑制血鏈球菌ROS的產生可有效減少血鏈球菌對巨噬細胞的毒害作用。Okahashi等[61]進一步研究了口腔鏈球菌SpxB對人類巨噬細胞的作用，闡明了口腔鏈球菌產生H2O2導致人類巨噬細胞死亡的機制。Okahashi等[4]還發現，口腔鏈球菌產生的H2O2可誘導宿主上皮細胞白細胞介素-6的表達，引起上皮細胞死亡。宿主細胞也能通過合成H2O2，起到殺菌或化學屏障的作用[28,62]。例如巨噬細胞針對病原菌的氧化爆發過程產生大量的ROS（包括H2O2），可殺滅病原菌或將病原菌屏蔽在由H2O2組成的化學屏障外，進而保護宿主。有意思的是，細菌還可以通過產生H2O2減少條件致病菌對宿主的侵害，乳桿菌可以通過產生H2O2抑制白假絲酵母菌對上皮細胞的黏附[63]。

在口腔中，生物膜中的微生物持續處于“戰爭與和平”的狀態，致病菌與宿主之間也時刻展開著“斗爭”。微生物可通過一系列途徑產生H2O2，限制有限生存資源內的競爭對手，并采取措施減少H2O2對自身的損害。H2O2是研究產H2O2菌株與對H2O2敏感菌間交互關系的良好切入口。H2O2在微生物與宿主間的關系中也發揮著重要的調節作用。系統研究H2O2在口腔微生態中的作用，揭示H2O2在維持口腔微生態平衡中的更多功能，有利于更好地理解口腔微生態系統。

[參考文獻]（略）

詳見《華西口腔醫學雜志》2017年4月第35卷第2期