年輕恒牙牙髓再生性治療的研究進展

宋光泰，靳秋晨

武漢大學口腔醫院兒童口腔科，湖北  武漢（430079)

【作者簡介】宋光泰，男，1964年出生于湖北，1985年畢業于湖北醫學院口腔系，獲學士學位，1990年畢業于湖北醫學院口腔系，獲碩士學位，2005年畢業于武漢大學口腔醫學院，獲博士學位。現任武漢大學口腔醫(學）院兒童口腔科主任，教授、主任醫師，研究生導師。兼任中華口腔醫學會兒童口腔醫學專業委員會第三、四屆副主任委員，第二、五屆常務委員；武漢口腔醫學會常務理事兼秘書長;亞洲兒童牙科學會(PDAA)理事(2008—2016);湖北省口腔醫學會常務理事；國際兒童牙科協會(IAPD)會員。2003—2004年，加拿大多倫多大學牙學院、McMaster大學訪問學者。1997—1999年，赴萊索托王國國家轉診醫院(Queen E.Ⅱ)援外醫療。系統掌握口腔醫學專業及相關學科知識，具有較高的理論水平和操作能力。作者特別擅長于兒童口腔疾病的診斷、治療及預防，負責和參加了本科生、研究生等多層次教學工作，對PBL教學有較深研究。負責和參與十余項科研項目，發表論文30余篇，多次參加全國及國際性學術會議。

【摘要】個體患牙髓病或根尖周病后，年輕恒牙牙根的繼續生長發育受阻，因此，如何保證患牙根尖的正常形成和繼續生長發育對口腔醫生而言極具挑戰。近年來報道的牙髓再生治療病例，其利用根管內殘余牙髓組織、根尖周或牙周組織中干細胞的再生分化能力，在合適的條件誘導下再生出新的高度血管化并富含結締組織的活髓，促使牙根繼續生長發育，牙根長度增加、根管壁增厚、根尖孔縮窄閉合，而且臨床檢查和影像學輔助檢查的結果均較理想，這具有劃時代的意義。牙髓再生基于組織工程學，以達到用新生牙髓組織代替原有病變牙髓組織目的。其包括兩種理念：一是牙髓血運重建，誘導根尖部干細胞遷移和分化，在患牙根管內新生出有活力的牙髓樣組織，完成牙根繼續生長發育；二是運用組織工程技術，將具有增殖分化潛能的干細胞和適宜的生物活性支架物質置入患牙根管內，在一定的生長因子誘導下，產生新的牙本質牙髓復合體(dentin-pulpcomplex,DPC)，實現牙髓再生。筆者就這兩部分的研究進展作一闡述。

【關鍵詞】年輕恒牙；牙髓再生；牙髓再血管化；組織工程；生長因子

【引用著錄格式】宋光泰,靳秋晨.年輕恒牙牙髓再生性治療的研究進展[J].口腔疾病防治，2016,24(12)：681­-687.

The research progress ofregenerative endodontic treatment for immature permanent teeth

SONGGuang-tai, JIN Qiu-chen

Departmentof Pediatrics Dentistry, School & Hospital of Stomatology, WuhanUniversity, Wuhan 430079, China

Correspondingauthor: SONG Guang-tai, Email: [email protected], Tel:0086-27-87686262

【Abstract】 The pulpal orperiapical diseases of immature permanent teeth often lead to incomplete rootdevelop­ment. It is a challenge for us to figure out how to ensure thecontinuous growth of the teeth and the formation of roots.There are many cases about pulpregeneration reported recently. With the regeneration and differentiationability of stem cells, which exist in residual pulp tissue, periapical andperiodontal tissues, the regeneration of new vital pulp tis­sue was inducedunder proper conditions, which is highly vascularized and rich in connectivetissue, thus prompting continuous root growth and development, increasing rootlength, thickening root canal walls, and facilitating the coarcta­tion of theapical foramen. Besides, clinical and radiographic examinations showssuccessful results about the regenera­tive treatment, which is of milestonesignificance. The pulp regeneration treatment is designed to replace thepathologi­cal dental pulp tissue with new regenerated pulp tissue, based onbiological tissue engineering process. This process in­cludes two key parts:one is pulp revascularization, regenerating new vital pulp tissue in the rootcanal to achieve the continuous root growth and development; the other istissue engineering, new pulp dentin complex is regenerated by the stem cellsunder the induction of suitable biological active scaffolds and growth factors.This article reviews about the re­search progress and clinical characteristicsof aforementioned two key parts.

【Keywords】 Immature permanenttooth; Pulp regeneration; Pulp revascularization; Tissue engineering; Growthfactor

【收稿日期】2016-02-16；【修回日期】2016-08-01

【基金項目】湖北省自然科學基金(2015CFB258)

【通訊作者】宋光泰，教授，博士，E-mail ：[email protected]

年輕恒牙是指萌出后沒有到達牙合平面、形態和結構沒有完全發育成熟、根尖孔未完全閉合的恒牙。年輕恒牙從牙齒開始萌出直至牙根達到應有的長度需2~3年，而實現根尖孔縮窄一般需要3~5年。年輕恒牙髓腔中的牙髓組織結構與成熟恒牙相比較為疏松，其中含較多細胞成分，但相對缺乏纖維成分，且富含血管，具有旺盛的生命力，且由于根尖孔粗大敞開，若牙髓組織發生炎癥，感染極容易在牙髓、根尖周組織之間擴散。而此期間常因齲病、外傷等多種原因致使牙髓感染壞死，牙根發育終止，導致根尖孔呈開放狀態。對于此類患牙，傳統的治療方法有兩種_：根尖手術后倒充填治療和根尖誘導成形術后行根管治療。倒充填治療只能封閉敞開的根尖孔，不能增加牙根長度，亦無法使牙根繼續生長發育，導致冠根比大，不利于患牙遠期保存；根尖誘導成形術雖能一定程度誘導根尖閉合，形成一種人丁根尖屏障，但療程較長、復診次數多、根管系統有再感染的可能^[1]，此外形成的牙根形態與正常牙根不同，牙根質地脆弱易致牙頸部折斷^[2]。此外，完善的根管治療雖能延長患牙在口腔內保存時間，但與健康牙齒相比更易脫落。近些年來，隨著分子生物學、再生醫學、組織丁程學等眾多相關學科的迅猛發展，逐漸產生“再生性牙髓治療（RET)”的理念，即以具有生物活性的新生牙髓組織代替病變的牙本質牙髓復合體，以恢復牙體組織的生命和活力^[3]。早在1971年，Nygaard-Ostby等^[4]學者首次觀察到摘除牙髓組織后的牙齒在根尖血液呈充盈狀態時的反應，由于當時技術、材料和器械等方面的限制，該嘗試雖未獲得成功，但被認為是牙髓再生的先驅。牙髓再生的目標為：①在牙髓腔內生成一種富含血管、神經及成牙本質樣細胞的類牙髓樣的組織，尤其是形成新生的牙本質牙髓復合體，與牙本質通過成牙本質細胞緊密連接，以引導牙本質的規律性沉積;②在根尖端實現牙根繼續生長伸長，形成根尖封閉并通過縮窄的根尖孔與根尖周組織相連；③含有神經組織和新生血管，即“功能性的牙髓再生”。因此，牙髓再生是在組織丁程的基礎上，實現牙髓再血管化與功能性再生，包括成牙本質細胞和（或）神經纖維再生，如果沒有組織丁程或牙髓再血管化，牙髓再生將無法實現。但是，組織丁程技術應用于臨床牙髓再生治療，還需要更深人的探索，筆者就這兩部分的研究進展作一綜述。

1  牙髓再血管化

若要實現牙髓再生，為牙髓提供一個適宜生存的環境而保證血氧供應和抗感染能力是前提，以形成牙髓組織的血運重建，即牙髓再血管化。牙髓再生的研究也得益于之前的牙髓再血管化研究，早在1966年，Rule等^[5]報告了1例年輕下頜恒前磨牙牙髓壞死的病例，該患牙根管經過機械預備和多聯抗生素根管消毒后進行誘導出血，觀察到牙根繼續發育、根尖孔閉合。Iwaya等^[6]也報告了1例13歲兒童的年輕下頜前磨牙外傷、牙髓壞死后，實現牙髓再血管化、根尖孔閉合和根管壁增厚的病例。Banchs等^[7]首先提出了牙髓再血管化(revascularization)”的概念，目的是代替年輕恒牙中壞死或感染的病變牙髓組織，再生新的血管、神經等組織，由此牙根得以進一步生長發育。目前，牙髓再血管化治療已趨常態化，美國牙髓病協會和歐洲牙髓病協會已出版規范的臨床指南。

牙髓再血管化的治療核心在于嚴格控制根管系統感染、給予組織新生的基質(如自體血凝塊，或富血小板血漿、濃縮生長因子等植人），同時在其冠方嚴密充填和封閉，以此保證適宜的生物學環境利于血管再生的實現。成功實現牙髓再血管化的前提是:根尖孔直徑>1mm。其臨床成功取決于三個重要方面_:根管系統的徹底消毒、支架性基質的存在、嚴密的冠方封閉^[12]。

1.1根管系統的徹底消毒

1.1.1無機械預備  機械預備不僅使薄弱的根管牙本質壁更脆弱，而且會破壞存在于根尖區的干細胞。根尖區在成牙本質過程中會釋放部分生長因子，成牙本質細胞和Hertwig’s上皮根鞘細胞是實現正常牙根發育所必需的細胞，可分化產生次級牙本質細胞，該細胞對根管內壁上牙本質的規律性沉積有誘導作用，實現根管壁增厚及牙根長度的增加，它們大量存在于年輕恒牙根尖區域，能夠抵抗一定的炎癥感染，機械預備的同時也會清除這些生長因子和再生過程中必需的其他細胞 ^[13]。Cehreli等^[14]的研究表明，盡管相關病例少，不具有統計學意義，但仍發現一些未經根管機械預備的患牙在術后可以重獲活力。因此，大多數學者贊同在牙髓再血管化的治療過程中無需機械預備根管系統，以維持干細胞活性，避免削弱過于薄弱的根管壁。

1.1.2沖洗  沖洗在初步根管消毒中發揮重要作用，沖洗劑應具有最大的殺菌抑菌功效，同時對干細胞和成纖維細胞有最小的細胞毒性，以維持其活力及增殖、分化能力。細菌侵人到根管系統，將形成一層細菌性生物膜，黏附在根管內壁并堵塞牙本質小管。為達到最佳的根管消毒效果，必須徹底清除細菌生物膜，如使用“根管刷”(root canal brush)等工具，有效清除細菌生物膜，同時不至于破壞牙體硬組織，然而使用此類丁具存在非生物相容性物質(刷毛）殘留于根管內的風險。沖洗過程中使用超聲振蕩可以產生空穴效應、聲流效應以及熱效應，加快沖洗劑與細菌性生物膜的化學反應以達到強化對根管系統內各種細菌及微生物的殺滅或抑制的效果，但在超聲沖洗振蕩過程中必須注意盡量不使超聲丁作尖直接與根管內壁接觸。

目前臨床應用的沖洗劑種類繁多_：①過氧化氫，人體組織中含有過氧化氫酶，接觸到過氧化氫時能夠釋放出新生氧，其發泡作用能將根管滲出及壞死組織清除，同時具有止血功能，但過氧化氫的組織溶解性能較差、作用時間短暫、有發生疼痛和術后腫脹等不良反應的可能。②次氯酸鈉，次氯酸鈉是目前臨床使用最多的一種根管沖洗劑，能夠較強地溶解牙髓壞死組織和根管玷污層中的有機物，推薦的使用濃度從0.50%-5.25%不等，細胞毒性與濃度成正相關，2.5%的濃度兼具高效的抑菌殺菌作用和較低細胞毒性，為臨床最適合選用的濃度^[15]。美國牙髓病協會推薦的濃度是1.5%，每根管20mL^[16]。此外研究發現若次氯酸鈉沖洗劑的溫度升高，其瞬時溶解組織的能力、沖洗的效果也將同步加強。③氯己定，具有廣譜抗菌的效果，與次氯酸鈉的抗菌效果類似，尤其能較強地抑制革蘭陽性菌、念珠菌感染，且一般對氯己定不容易產生耐藥菌株。氯己定沒有組織溶解作用，亦可引起牙體著色，因此在氯己定沖洗間交替使用生理鹽水沖洗，清除產生的色素。④乙二胺四乙酸（EDTA)，EDTA是一種強效螯合劑，在臨床應用中經常與其他沖洗劑（如次氯酸鈉溶液)聯合使用。通過與細菌生長所必需的金屬離子螯合而具有一定抗微生物性能。17%的EDTA沖洗劑在臨床丁作中常用作去除牙本質中的有機物和無機物，以及牙髓組織中的部分無機物成分，亦可清除牙本質玷污層并開放牙本質小管，從而提高沖洗劑及根管內封藥的效果^[17-18]。Ring等^[19]研究發現EDTA與2%氯己定聯合使用后導致干細胞無法存活，還會形成氯鹽沉積在根管內，這些沉積物有細胞毒性且會阻礙干細胞在根管壁上的附著。建議在使用EDTA沖洗后用生理鹽水沖洗以減少沉淀物沉積，同時可以清除組織殘片和沖洗劑的殘留。

1.2支架性基質

1.2.1自體血凝塊   刺激根尖區出血，可在根管內形成支架樣結構的血凝塊，支持根尖周細胞及間充質干細胞粘附、遷移、分化。血凝塊中富含生長因子，能夠對成纖維細胞、成骨細胞、成牙本質細胞等多種重要細胞的增殖和分化過程產生刺激作用，在組織再生中起到了關鍵作用。在刺激根尖出血時，盡量不使用含血管收縮劑的麻醉劑，以保證根管內有充足的血量^[21]。目前，自體血凝塊作為牙髓再血管化的基質而在臨床中最為常用。

1.2.2   富血小板血漿（PRP)    PRP是將自體的全血通過離心所得到的一種血小板濃縮物，其中富含大量生長因子，可以促進形成膠原蛋白。動物實驗顯示，對比血凝塊與PRP在牙髓再生中的作用，發現無論是新生牙髓或者根管內硬組織的生成，兩者差異均無統計學意義^[22]。臨床應用中出現根尖部血管破壞，刺激根尖出血時未形成血凝塊，或血凝塊形成質量不佳時，推薦使用PRP。Torabinejad等^[23]報道了1例上頜年輕恒前磨牙外傷脫位牙髓壞死再植后，使用PRP實現牙髓再血管化的病例。5~6個月后對患者隨訪的影像學檢查證實，有牙根的繼續生長發育和根管壁厚度的增加，同時牙髓活力檢測到陽性反應。

然而PRP的制備過程復雜繁瑣，成功率不高，需要經過二次離心，而且要加人牛凝血酶、氯化鈣等額外的添加劑。另外其安全性以及是否會引起感染等問題仍不確定，確切作用機制及PRP能發揮作用的劑量尚無確切依據，這些問題嚴重限制了其在研究及臨床中的應用^[24]。

1.2.3    富血小板纖維蛋白(PRF)     PRF是可應用到牙髓血管再生過程中的潛在支架材料^[25]，富含血管內皮生長因子（VEGF)、血小板源性生長因子（PDGF)、轉化生長因子等生長因子。能夠將生長因子緩釋，增強多種細胞的增殖、分化，促進血管生成，同時PRF也具有抗炎和抗感染的功能，此外亦是能將礦化物三氧化物聚合體（MTA)的作用最大化的理想基質物質。

1.2.4   濃縮生長因子（CGF)      自體來源的GCF，是第2代血漿提取產物，有完全獨特屬性的一種愈合型的生物性材料，最早由Sacco在2006年開發研制而來。CGF采用Medifuge離心機精準變速離心制成，與PRP的制備相比，過程更為簡單、成功率較高，而且由于不必添加額外的試劑，不會引起感染。此外，經過精準變速離心后，纖維蛋白原發生聚合作用，內部的纖維交織形成三維纖維蛋白聚合網絡。該三維網狀結構柔軟富有彈性，有一定的孔徑與滲透性，能夠很好地滯納血小板和其他循環分子。

制取CGF凝膠時，這種獨特的預設變速離心法將激活血小板，使血小板顆粒釋放多種生長因子，這些因子具有促進細胞增殖分化、合成基質物質和生成血管的作用。而CGF獨特的三維網格狀支架結構又能支持引導經生長因子誘導產生的新生組織的生長。目前經過科學證實的濃縮生長因子中包含的生長因子有：轉移生長因子(TGF)、PDGF、類膜島素生長因子(IGF)、表皮生長因子(EGF)、VEGF和成纖維細胞生長因子(FGF)等。這些因子均可單獨或和其他因子聯合參與或促進血管、神經、礦化組織的形成，以及牙髓、牙周組織再生的過程^[26]。目前有學者已將CGF應用于牙髓血管再生，收到良好的臨床效果，但長期效果仍需進一步觀察。

1.3冠方封閉

研究證實，為避免細菌從冠方侵人根管系統造成根管內再感染，應進行嚴密的冠方充填封閉，這也是成功實現牙髓血管再生的基本條件之一⑴。根據多數學者的建議，可在血凝塊的上方雙層材料封閉，例如使用MTA和樹脂粘接進行冠方充填^[27-33]。也有一些學者推薦三層材料封閉，亦即在MTA和復合樹脂之間加人一層玻璃離子作為第二層封閉材料，以使冠方的封閉更為嚴密。

在牙髓血管再生術中MTA常常和牙髓組織、根管內血凝塊或再生組織等直接接觸，具備良好的生物相容性、封閉性、穩定性和較強的抑菌性，同時具有良好的親水性和其獨特的硬固性能。然而不足之處是臨床操作中固化時間長、花費高、而且易使牙體組織變色。Gelman等^[35]建議改用白色MTA代替灰色MTA，避免術后牙冠顏色的改變。Khetarpal等^[36]建議使用桂酸三鈣(Biodentine)代替MTA放置于血凝塊的上方。Biodentine是一種具有良好的生物活性和封閉特性的牙本質代替物，其達到硬固所需的時間與MTA相比更短，臨床操作過程更簡便，避免了MTA引起牙冠顏色改變的可能。

2  組織工程技術

組織工程被定義為應用組織工程學和生命科學來構建恢復、維持、提高組織功能的生物替代品的跨學科領域^[37]。此原理應用于口腔醫學研究領域，即牙組織工程。牙組織工程的三要素包括_：牙源性干細胞、支架、生長因子。針對牙髓再生的組織工程，需要牙髓干細胞及其相應的支架與生長因子協同作用。

2.1   牙源性干細胞

2000年，Gronthos等^[38]自牙髓中分離出牙髓干細胞，為組織工程學在口腔領域的研究奠定了基礎。自體牙髓干細胞是牙髓再生過程中最具潛力的一種干細胞，引發免疫反應的可能性較小。與非牙髓干細胞（如骨髓基質干細胞）相比，它們表現出更顯著的分化潛能(形成典型的牙齒樣組織，兼具成釉及成牙本質功能）^[39]。

到目前為止，已經分離和描述的牙源性干細胞有以下4種：牙髓干細胞（DPSCs)、脫落乳牙干細胞、根尖牙乳頭干細胞(SCAP)、牙周膜干細胞(PDLSCs)，這幾種干細胞具有增殖和多向分化的能力，而且較易獲得，易于通過注射器注射(干細胞注射療法）。但使用該技術，細胞存活率較低，可能會遷移至體內不同部位、導致異常形式的礦化^[41]，為解決此問題，需要將干細胞與支架材料相結合使用。

2.2   支架

支架可為組織再生中的干細胞提供一個相對穩固的三維結構以保證其正常生長、發育和分化。選擇支架材料，主要考慮以下幾方面：良好的組織相容性，具有多孔性結構以容納細胞^42]，同時可降解，能夠逐漸被再生組織替代分解而無需通過手術的方式取出，且支架材料的分解速度最好與組織新生的速度保持一致。支架材料還應具備合適的孔徑率及孔徑，以便于細胞及養分的進人、擴散和代謝廢物的排出^[43]。目前美國食品藥品管理局（FDA)已經批準大多數的組織工程所使用的生物材料作為支架，包括天然支架或人工合成支架，天然支架包括膠原、牙本質、纖維蛋白、蠶絲、藻酸鹽等，人工合成支架包括各種聚合物，例如聚乳酸(PLA)、聚輕基乙酸（PGA)等。對牙髓組織再生而言，聚合物水凝膠⁴⁴中含水量高、柔軟具有彈性、與水及生物流體表面張力低，水凝膠與活組織具有相似的物理性質，能夠無創性地直接被注射進根管系統內部。另一種可注射支架是卩磷酸三鈣^45]。此外，經過處理的牙本質基質也可為牙組織再生提供合適的環境^[46]，蠶絲支架可在牙釉質、牙本質形成過程中促進礦化，其支架孔隙能夠引導組織礦化^[47]。另外還有一種釉基質蛋白，主要成分是釉原蛋白，在生物礦化和硬組織形成中意義重大，也是一種潛在的支架材料^[48]。

2.3    生長因子

生長因子是一類與受體結合、誘導細胞增殖和分化的蛋白質。很多生長因子具有多效性，能夠刺激各種類型細胞誘導細胞分裂，而另一些生長因子則更有細胞特異性^[49]。生長因子在牙髓一牙本質再生過程中發揮了重要的信號傳導作用，其中重要的生長因子包括_：轉移生長因子（TGF)、骨形成蛋白(BMP)。

成牙本質細胞分泌的TGF-P1和TGF-P3生長因子，在成牙本質細胞分化的信號傳導和刺激牙本質基質分泌的過程中具有特殊意義，分布在牙本質基質中，通過與牙本質基質的其他成分發生相互作用而保持活性。BMP-2、BMP-4和BMP-7被證實能夠在干細胞分化為成牙本質細胞過程中起誘導促進作用，促使牙本質形成。一些天然狀態下存在的物質可發揮生長因子的作用，釉基質衍生物作用于牙髓牙本質復合體時能夠釋放出具有生物活性的分子，同樣可誘導牙本質的形成。生長因子可通過多種方式導人_：直接加人生長因子成品、內源性釋放等，生長因子在體內半衰期較短，它們需要在一個更長的時間段內保持活性，因此，另一種方式即運輸能夠編碼生長因子的基因而不是生長因子本身，這就是基因療法。

目前，組織工程牙髓再生研究仍處于臨床前動物實驗階段。研究常用的干細胞有DPSCs、脫落乳牙干細胞和SCAP。有實驗證明在體外擴增培養DPSC、脫落乳牙干細胞和SCAP，通過支架分別植人大鼠皮下和豬的牙槽窩中，可形成牙本質牙髓復合體^[5"^51]。Huang等^[52在動物實驗中，將D，L-丙交酯和乙交酯多聚物生物支架和DPSC和SCAP細胞混合物放到預先處理的牙根管中并移植到大鼠皮下組織。3-4個月后取出植人物，經組織學分析發現有高質量的類牙髓組織形成，但其細胞結構有異于天然牙髓中成牙本質細胞，且新生組織中未見正常的神經結構。

除上述體外擴增培養干細胞之外，還可采用細胞歸巢的方法實現牙組織工程學上的牙髓再生。細胞歸巢即將含有各種信號分子的生物性支架植人根管，利用內源性干細胞誘導遷移，穩定于再生部位，刺激其增殖、分化形成新生組織。細胞歸巢利用的內源性細胞，生物相容性良好，克服并降低了體外干細胞擴增培養和移植的風險，但應注意選擇恰當的生長因子。該類研究目前也仍處在動物研究的臨床前期階段，且成果并不穩定，暫時也無臨床證據證明其治療方案的有效性，尚需要進一步的研究。

3  小結

美國牙髓病協會提出再生性牙髓病學將引領未來口腔醫學的發展方向。多例年輕恒牙牙髓壞死牙髓再血管化的臨床病例報告結果顯示，伴有牙根繼續發育和牙本質壁增厚，患牙活力測試有一定的反應。與傳統方法相比，牙髓再生治療在促進根尖周損傷的愈合、促進牙根發育及最大程度地保存患牙、提高存活率方面有較大的優勢。然而，至今牙髓組織再生的組織學機制尚未有定論，缺乏長期的隨訪觀察及預后評估資料，嚴重制約該技術在臨床上的推廣，牙髓再生的基礎理論與臨床應用仍需進一步的科學研究。

來源:口腔疾病防止雜志