摘要

目的：檢驗甲狀旁腺激素1受體（PTH1R）突變在原發性和恒牙期均有療效的假說。

材料和方法：從29名患者（8名家族患者和21名零星患者）的唾液樣本中提取DNA，這些患者提供牙齒缺失的臨床證據，以及未受影響的親屬（N = 22）。 對所有個體完成序列測定，然后對PTH1R基因的編碼區進行突變分析（N = 29）。

結果：29例中有8例在PTH1R基因中發現雜合致病變異體;基于與dbSNP，HGMD和ESP數據庫的比較，八個變體中的五個表示不同的突變。發現一個突變（c.1765 T＞C p.Trp89Arg）在家族內分離（n = 3）。所有變體的計算機分析揭示了推定的致病作用。據報道，PTH1R中的功能性突變定義了基因型-表型相關性，并且僅對一個或多個后牙有相應的影響; 單側或雙側受累，阻斷乳牙。

結論：PTH1R基因中報道了新的突變，包括受PFE影響的原發磨牙，從而為使用遺傳診斷工具進行早期診斷提供適當的管理依據。（Angle Orthod。2018; 88：275-282。）

關鍵詞：原發性萌出失敗（PFE）；牙萌出；PTH1R

1、引言

牙齒萌出是發育過程，由此骨內隱窩內發育的牙齒穿過頜骨進入口腔，直到達到功能性閉合。牙醫和正畸醫生的作用是監測牙斑的發生模式，以避免隨后出現的咬合問題，萌出障礙。 普通牙醫或牙科專家遇到由萌出障礙引起的咬合問題的患者并不罕見。 小兒牙科和正畸專家會定期監測正常牙齒萌出中的差異，如時間，次序和萌出程度。

正常的萌出過程需要牙齒以精確的雙側時間順序通過骨骼和口腔上皮，這必須與三個空間平面中的上頜骨和下頜骨的生長協調。（1）骨吸收，（2）牙齦吸收（二者都在牙囊上方）和（3）在毛囊頂端的根伸長。骨吸收是破骨細胞生成的結果，不需要牙齒萌出的力量，而是一種遺傳程序化的過程。這種吸收和替代過程之間平衡的改變是主要的萌出失敗（PFE）發展的決定性因素。然而，最近的研究將基因發現作為揭示PFE機制基礎的重要邏輯第一步。

PFE這個術語是由Proffit和Vig（1981）提出的，表明萌出機制中的一個缺陷不是由于明顯的阻塞造成的。在大多數情況下，受PFE影響的牙齒部分萌出（supracrestally），然后在它們達到功能性閉塞之前被阻滯。基于PFE受影響隊列的臨床和基因特征，與其他萌出性疾病相比，提供了一個診斷標準。這個標準定義了確定萌出途徑是否清晰的至關重要的第一步。也就是說，應該使用當前和歷史臨床X光片和照片來排除機械阻塞的存在。這包括了解過去的阻塞是否導致受影響的牙齒的當前受限位置。第二步是確定是否至少有一個第一磨牙受到影響。不同頻率發生的其他特征包括主要受影響的后牙，主要牙和恒牙的受累，單側或雙側發生傾向于施加正畸力后發生關節僵硬，以及沒有全身受累。

自從發現PTH1R基因負責PFE的發展以來，文獻繼續在PTH1R中聚集PFE相關的突變。 揭開基因型 - 表型相關性的道路仍然相當難以捉摸，甚至更令人困惑，因為由PTH1R突變引起的疾病譜非常廣泛。事實上，PTH1R基因突變與致死性侏儒癥，軟骨發育不良和萌出特異性牙齒疾病相關。對這種類似突變表型譜的完整理解是神秘的，需要對PTH1R基因的結構和功能有完整的理解。

該基因位于染色體3p21-p22.1，MIM＃上，含有16個外顯子。由此產生的蛋白質是跨膜糖蛋白（593個氨基酸），由延伸的細胞外配體結合氨基末端，細胞內G蛋白相關羧基末端結構域，由28個氨基酸形成的信號肽，具有150個氨基酸的具有激素結合位點的胞外結構域，以及包含7個α-螺旋和胞間結構域的跨膜結構域。細胞外結構域結合兩種不同的配體：甲狀旁腺激素（PTH），主要作用于肝臟和骨細胞以及甲狀旁腺激素相關肽（PTHrP）。這兩種配體均可調節細胞內鈣水平并有利于骨代謝，PTH僅由甲狀旁腺產生。然而，許多組織產生PTHrP和細胞類型，包括內皮細胞，軟骨細胞，骨骼，肝臟，平滑肌細胞和牙胚。只有一個正常的PTH1R拷貝足夠，但必須在大多數組織。在牙齒發育中，需要大量的PTH1R15。由于這個原因，推測PFE表型可能是PTH1R劑量依賴性失活的結果。此外，觀察到一些PTH1R基因的常染色體顯性突變不影響除骨關節炎以外的牙齒或其他骨骼結構。最近的研究證實骨關節炎與軟骨細胞中低水平的PTH1R之間存在關聯。

這個后基因組時代的基因研究的總體目標是提供有意義的臨床應用來提高診斷的準確性。 對PFE的研究繼續完善萌出性疾病的描述，但對其發病機制的完整理解仍然難以捉摸。 此外，基于對PFE表型的完整解剖的臨床參數應該包括牙列和顱面結構的基因型：表型相關性。以前的研究表明，PFE在主要牙列中發生更少，但始終包括恒牙。在這份報告中，表現出混合牙列和永久牙列的明顯參與的家庭和多個人創造了擴大診斷窗口，并因此在更早的年齡管理的機會。因此，這些發現標志著一個機會來完善PFE和PTH1R的基因型：表型相關性并提高診斷的準確性。

2、材料與方法

受試者

一組51名患者（年齡在7至45歲之間）患有家族性萌出性疾病（至少在一名家庭成員中至少有一顆牙包括），被招募參加這項研究。這些患者中有29名具有PFE的特征。招募了22名未受影響的親屬并擔任對照受試者。通過（1）由口內和口外照片組成的臨床檢查，（2）全景X射線和（3）患者訪談來確定低咬合診斷。萌出性障礙診斷的標準包括先前描述的表型特征，包括PFE類型。患者的臨床檢查在羅馬圣心天主教大學牙科研究所（UCSC）進行，突變研究在 醫學遺傳研究所的實驗室和UCSC的牙科研究所。這項研究得到了UCSC倫理委員會的批準。

突變分析

使用Wizard基因組DNA純化試劑盒（Promega Corp，Fitch-burg，Wisc）提取唾液中的DNA。使用針對所有編碼區和PTH1R基因的內含子-外顯子連接點設計的引物（Genamics Expression 1.1 Bio-Soft.Net Sequence Analysis and Alignment for Windows; 表1）對所有受試者進行序列分析，隨后進行PTH1R的突變分析。 用含有血清堿性磷酸酶（SAP）和外切核酸酶的PCR產物預測序試劑盒（Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ）純化PCR產物。 用Big Dye Terminator 3.1循環測序試劑盒（Life Technologies，Carlsbad，Calif。）進行PCR產物的測序，用Big Dye X-Terminator試劑盒（Life Technologies）純化，并使用自動測序儀AB1 3130 Genetic Analyzer（Life Technologies）。 將變體與dbSNP，HGMD和ESP數據庫進行比較以確定變體是新的還是先前報道的。

表1.設計并用于PCR擴增PTH1R基因（退火溫度，558℃）的引物組

硅片分析

序列數據使用Mutation Surveyor V3.3進行分析。 通過SIFT，PolyPhen2和AlignGVGD評估未知序列變體。 使用Alamut軟件v.1.5的生物信息學工具（Interactive Biosoftware，Inc。），基于五種不同算法（SpliceSiteFinder，MaxEntScan，NNSPLICE，GeneSplicer，人類剪接發現者）評估懷疑影響正確剪接的變體的剪接位點強度或分支點預測。http://www.interactive-biosoftware.com/alamut.html）。 通過使用專用軟件Sorting Intolerant from Tolerant（SIFT）和Phenotyping（PolyPhen-2），使用計算機分析來評估蛋白質的折疊和這種變體的最終致病性。

3、結果

突變和硅分析

表2. PFE患者中的突變總結

表3.數據庫

29例中有8例在PTH1R基因中發現雜合致病變異。表2顯示了本研究中確定的突變概況。簡言之，在8個受影響的受試者中有5個鑒定出三種錯義突變，這些受試者以前沒有根據與已發表的數據庫的比較（表3）進行描述。在兩個兄弟中鑒定出CTCF結合位點的變體（c.313×32 A.G rs113566258 SNP）（圖1A，B）。

圖1.（A，B）兩兄弟的口內照片。全景：外顯子5的下游變體（CTCF結合位點）rs113566258 SNPc.313±32A＞G; 在外顯子16中的變體（位置3：46903467）c.1593-95 Del C，p.531 / 532; 外顯子10中的同義變體（位置3：46899419）c.1152 G＞A.

兄弟姐妹被診斷為I型PFE并顯示雙邊呈現。該變體（PTH1R基因的外顯子5的下游c.313×32 A.G）發生在與轉錄因子相互作用的調節區中。除了這種突變之外，這些兄弟還受到第二個突變的影響，這些突變對每一個都是獨特的：一個兄弟姐妹（II：1）也存在在外顯子16的基因氨基末端發生的移碼缺失，c.1593DelC ，第（Pro532Leufs *）（圖1A，B）。在另一個同胞（II：3）中，鑒定出在蛋白質氨基酸序列水平不引起變異的外顯子，c.1152GA（rs200475872;圖1A，B）中的同義變體，但涉及改變含氮堿。基于計算機分析，這種改變可能會影響mRNA的折疊并影響其半衰期和蛋白質生產。在這個患者樣本中，在一個孤立的病例中發現了同樣的同義變體c.1152G.A，由于PFE而具有嚴重的開合（圖2）。

圖2.口內照片。全景：外顯子10中的同義變體（位置3：46899419）c.1152 G＞A.

在PFE的另一個孤立案例中，重新發生錯義突變，c.64 C＞T p。 先前未描述的Ala22Val在外顯子3中發現。這種變體發生在信號肽水平的PTH1R蛋白的胞外結構域中，并且它確定了氨基酸的變化。但是，由于兩個氨基酸具有相同的電荷，所以該突變不被認為是高致病性的。

最后，在數據庫中以前沒有報道的錯義變體在外顯子16 c.1765 T＞C p.Trp89Arg中發現。 在同一家庭的三個成員 - 母親，女兒和兒子（圖3A，B）中發現的錯義變體-負責用精氨酸p：Trp89Arg取代氨基酸色氨酸，這是一種具有不同化學特性的氨基酸。該突變發生在PTH1R蛋白質的胞質結構域中，并參與受體與激活細胞內級聯信號的G蛋白的相互作用。此外，計算機結果表明，PTH1R蛋白質中的這種氨基酸取代改變了蛋白質的結構和功能，因為它發生在蛋白質的催化結構域內。

圖3.（A，B）兩兄弟的口內照片。全景：外顯子16中的家族錯義變體c.1765 T＞C p.589 W＞R

屬于2號家庭的小女兒（2：2）表現出更復雜的臨床表現，缺乏永久性以及暫時性系列和囊性結構元素的萌出（圖3A，B）。在哥哥（II：1;圖3A，B）中發現由于包括多顆恒牙的嚴重的雙側后牙開合。最后，患者II：1和II：2的母親表現出雙側上頜第一磨牙和下磨牙的包埋。發現前磨牙層面沒有咬合接觸（圖3A，B）。

臨床表現

本研究中確定的低咬合的臨床特征與PFE基于基因診斷和萌出障礙診斷標準的應用相一致。對特定相關牙科特征的仔細臨床檢查包括以下內容：至少一顆牙包括低咬合，局限于后部區域，單側（38％;圖1A）和雙側呈現（35％;圖1B和2），至少有一個暫時性后牙（48％暫時;圖1A，B和3A; 55％永久性，圖3B）。此外，觀察到牙面特征如下：由于受影響側的側向開放咬傷的嚴重程度而引起的垂直骨骼不對稱（35％;圖1A，B和圖3A，B）;由下頜骨側向偏離組成的面部不對稱（圖1A，B和圖2;表4）。這種不對稱在單側開合患者中更為明顯。進一步發現受影響的患者與先前報道的患者存在上頜骨收縮和III類牙齒/骨骼關系（28％;圖1A，B和圖2）。至少有一例患者出現了相對于9名患者的低咬合。表4總結了PTH1R的表型結果和相關的突變分析（N = 8）。

表4. PTH1R突變患者特征總結

4、討論

在這項研究中，確定了五種突變：先前報道了三種新型和兩種突變（rs113566258和rs20047872）。PTH1R改變包括（1）轉錄因子（CTCF結合位點）結合的基因調節區水平的變體，（2）移碼缺失，（3）同義變體和（4）兩種錯義變體。估計某些變體的致病性是困難的，但是通過在導致產生截短蛋白的那些變體中的計算機分析中支持PTH1R基因突變和PFE之間的原因-和效應關系。 未來的功能研究將對本報告中描述的突變的后果提供更詳細的分析。

本次隊列研究對孤立性和家族性病例進行了調查，其中包括五個家族，其中一個以上成員受到至少一個磨牙癥的影響。這項研究的一個重要發現是，在兩個家庭和三名不相關的患者中發現的變體與混合牙列中的低咬合有關。與混合牙列中的PFE呈正相關，因此該發現支持了在混合牙列階段期間早期基因診斷的方案的發展。

這些結果標志著混合牙列參與PTH1R基因功能性突變的個體的最全面文件。家族2中發現的錯義突變與報道的類似，并且也顯示出類似的表型。雖然強調家族遺傳作為檢測PFE的一個引人注目的標志，但本研究的結果支持調查包括原發性牙齒和家族史作為改善早期檢測的綜合方法。發現一個c.1092delG，一個年輕男孩和他的父母的移碼突變，顯示了混合牙列的參與，導致截斷蛋白的c.1092delG變體也與骨骼和牙齒三類錯（牙合）相關，導致 溫和的開放式咬合在右側。本報告通過鑒定多個家族的新型突變（圖1A，B）擴大了Rhoads等人的發現。

5、結論

這項研究的結果證實，PTH1R基因的突變導致萌出失敗，其臨床表現與之前對PFE的描述一致。這些表型可以在乳牙的水平早期發現，然后在恒牙列中發現。

臨床診斷結合PTH1R基因的遺傳分析不僅可以確保早期診斷，還可以作為篩查潛在受影響親屬的警報。

總而言之，PFE的頻率和顯示PTH1R基因遺傳異質性的患者數量表明由PTH1R中的突變引起的PFE被低估。

基于這些觀察結果，基因引導正畸可以帶來臨床，治療甚至經濟上的優勢，以管理牙齒萌出的問題。

通過基因檢查可以指導臨床醫生制定正確的正畸治療計劃，避免導致失敗并使他們遭受醫源性損傷所帶來的不必要的和長期的治療。

來源：浙一口腔正畸林軍